Гетерогенность дендритных клеток толстой кишки и немелкоклеточного рака легкого (TUM-DC)

ПРЕДПОСЫЛКИ Активация адаптивных иммунных ответов зависит от дендритных клеток (ДК) и макрофагов, миелоидных клеток врожденной иммунной системы, специализирующихся на презентации антигена и активации Т-клеток. Эта особенность миелоидных клеток является фундаментальной не только при инфекционных заболеваниях, но и в контексте рака, поскольку фагоциты захватывают антигены, ассоциированные с раковыми клетками, и представляют их Т-клеткам в микроокружении опухоли или в дренирующих опухоль лимфатических узлах для получения противоопухолевого ответа. .

В частности, наблюдалась положительная корреляция между общим опухолевым содержанием ДК и выживаемостью онкологических больных с различными опухолями, а также лучшая реактивность на терапию, основанную на использовании ингибиторов иммуноконтрольных точек (ИКТ).

Недавно было выявлено наличие различных подтипов дендритных клеток, а также специфическая адаптация каждого подтипа к опухолевой среде.

Это критический момент, поскольку функциональная гетерогенность ДК, макрофагов и Т-клеток в микроокружении опухоли, вероятно, является одним из факторов, ответственных за успех или неудачу противоопухолевой иммунотерапии. Терапия на основе ICB произвела революцию в лечении пациентов с онкологическими заболеваниями, такими как меланома и рак легких, но в настоящее время они полезны только для меньшинства пациентов. Улучшение понимания иммунного микроокружения опухоли является ключом к прогнозированию клинических ответов на существующие методы лечения и, возможно, к разработке новых методов иммунотерапии.

ОБОСНОВАНИЕ Миелоидные клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, инфильтрируют многие различные типы опухолей и могут проявлять противоопухолевую функцию, активируя Т- и NK-клетки, или они могут выполнять проопухолевую активность, продуцируя противовоспалительные цитокины и ингибирующие молекулы. Присутствие в опухоли нескольких обычных подтипов ДК было связано с лучшим прогнозом, в то время как проопухолевая функция была предложена для нетрадиционных ДК, таких как CD14 + CD1c + ДК. Присутствие макрофагов связано с проопухолевым действием.

Исследователи предполагают, что функциональная гетерогенность миелоидных клеток и Т-клеток в микроокружении опухоли является одним из факторов, ответственных за успех или неудачу противоопухолевого иммунного ответа. Определение с высоким разрешением подтипов миелоидных клеток и ассоциированных с опухолью Т-клеток, их фенотипа, распределения в опухоли, а также их функциональных характеристик поможет понять сложность микроокружения опухоли.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ После сбора каждый образец будет идентифицирован и помечен уникальным идентификатором. Патолог возьмет образец материала и выберет ткань, которую можно использовать для эксперимента, после того, как он возьмет все необходимое для диагностических целей. Исследуемый образец будет помещен в пробирки и храниться на льду. Затем он будет отправлен в лабораторию Миланского университета Бикокка. Опухоль будет разрезана на части, и суспензии отдельных клеток будут приготовлены с помощью набора для диссоциации опухолей человека и диссоциатора softMACS ™ (Miltenyi Biotech) в соответствии со стандартным протоколом. Затем клеточные суспензии выделяют центрифугированием в градиенте плотности.

Исследователи проанализируют около 60 пациентов для иммунофлуоресцентных исследований и 4 пациентов для транскриптомного анализа отдельных клеток (секвенирование РНК одной клетки). Одноклеточный анализ, проведенный 4 пациентами, уже показал, что его достаточно для идентификации различных подтипов иммунных клеток. Иммунные клетки обрабатывают для получения клеточной суспензии, обогащенной миелоидными клетками. Это позволит проводить точный анализ подтипов ДК, макрофагов и CD4+ Т-клеток и выявлять даже очень редкие популяции, которые могут быть потеряны в невыбранных образцах из-за разбавления. Стратегия предварительной сортировки будет основываться на экспрессии CD45 и MHC класса II и на отсутствии экспрессии CD3, CD19, CD56, Ly6G для исключения T, B, NK и нейтрофилов.

Остаточный материал не сохраняется. Предполагается, что пациенты будут зарегистрированы и проанализированы в течение 5-летнего периода.

Есть 5 разных заданий:

Task1: Подготовка и секвенирование библиотеки РНК-seq одной клетки; Задача 2: Биоинформатический анализ РНК-секвенирования отдельных клеток; Задача 3: Проточный цитометрический анализ подтипов ДК, присутствующих в микроокружении опухоли; Задача 4: Пространственное распределение подтипов ДК в микроокружении опухоли. Задача 5: Оценка связи между подтипами миелоидных клеток, присутствующих в микроокружении опухоли, и выживаемостью;

Исследование завершится биоинформационным анализом данных и их проверкой с помощью проточного цитометрического анализа.