Heterogeniczność komórek dendrytycznych w raku okrężnicy i niedrobnokomórkowym raku płuca (TUM-DC)

TŁO Aktywacja adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych zależy od komórek dendrytycznych (DC) i makrofagów, komórek mieloidalnych wrodzonego układu odpornościowego wyspecjalizowanych w prezentacji antygenu i aktywacji limfocytów T. Ta szczególna cecha komórek szpikowych ma fundamentalne znaczenie nie tylko podczas chorób zakaźnych, ale także w kontekście raka, ponieważ fagocyty wychwytują antygeny związane z komórkami nowotworowymi i prezentują je komórkom T w mikrośrodowisku guza lub w węzłach chłonnych drenujących guz w celu uzyskania odpowiedzi przeciwnowotworowych .

W szczególności zaobserwowano dodatnią korelację między całkowitą zawartością guza DC a przeżyciem pacjentów z rakiem z różnymi nowotworami, a także lepszą reaktywnością na terapie oparte na zastosowaniu inhibitorów punktów kontrolnych (ICB).

Niedawno ujawniono obecność różnych podtypów komórek dendrytycznych, a także specyficzną adaptację każdego podtypu do środowiska guza.

Jest to punkt krytyczny, ponieważ funkcjonalna heterogeniczność DC, makrofagów i limfocytów T w mikrośrodowisku guza jest prawdopodobnie jednym z czynników odpowiedzialnych za sukces lub niepowodzenie immunoterapii przeciwnowotworowych. Terapie oparte na ICB zrewolucjonizowały leczenie pacjentów z nowotworami, takimi jak czerniak i rak płuc, ale obecnie są korzystne tylko dla mniejszości pacjentów. Lepsze zrozumienie mikrośrodowiska immunologicznego guza jest kluczem do przewidywania odpowiedzi klinicznych na istniejące terapie i być może opracowania nowych immunoterapii.

UZASADNIENIE Komórki szpikowe, takie jak komórki dendrytyczne i makrofagi, naciekają wiele różnych typów nowotworów i mogą wykazywać działanie przeciwnowotworowe poprzez aktywację komórek T i NK lub mogą działać pronowotworowo, wytwarzając przeciwzapalne cytokiny i cząsteczki hamujące. Obecność w guzie kilku konwencjonalnych podtypów DC wiąże się z lepszym rokowaniem, podczas gdy zaproponowano funkcję pronowotworową dla niekonwencjonalnych DC, takich jak CD14 + CD1c + DC. Obecność makrofagów została powiązana z działaniem pronowotworowym.

Badacze stawiają hipotezę, że funkcjonalna heterogeniczność komórek mieloidalnych i limfocytów T w mikrośrodowisku guza jest jednym z czynników odpowiedzialnych za powodzenie lub niepowodzenie przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Definicja w wysokiej rozdzielczości podtypów komórek szpikowych i komórek T związanych z nowotworem, ich fenotypu, rozmieszczenia w obrębie guza, a także ich charakterystyki funkcjonalnej, pomoże zrozumieć złożoność mikrośrodowiska guza.

PROJEKT BADANIA Po pobraniu każda próbka zostanie zidentyfikowana i oznaczona unikalnym identyfikatorem. Patolog pobierze próbkę materiału i wybierze tkankę, która może być użyta do eksperymentu po pobraniu wszystkiego, co jest potrzebne do celów diagnostycznych. Próbka badawcza zostanie umieszczona w probówkach i przechowywana w lodzie. Następnie zostanie wysłany do laboratorium University of Milano-Bicocca. Guz zostanie pocięty na kawałki i przygotowane zostaną zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą zestawu do dysocjacji ludzkiego guza i dysocjatora GentleMACS™ (Miltenyi Biotech) zgodnie ze standardowym protokołem. Zawiesiny komórek będą następnie izolowane przez wirowanie w gradiencie gęstości.

Badacze przeanalizują około 60 pacjentów pod kątem badań immunofluorescencyjnych i 4 pacjentów pod kątem analiz transkryptomicznych pojedynczych komórek (seq pojedynczej komórki RNA). Analiza pojedynczych komórek przeprowadzona przez 4 pacjentów okazała się już wystarczająca do zidentyfikowania różnych podtypów komórek odpornościowych. Komórki odpornościowe będą traktowane w celu uzyskania zawiesiny komórkowej wzbogaconej w komórki szpikowe. Pozwoli to na dokładną analizę podtypów DC, makrofagów i limfocytów T CD4+ oraz identyfikację nawet bardzo rzadkich populacji, które mogłyby zostać utracone w niewyselekcjonowanych próbkach z powodu rozcieńczenia. Strategia wstępnego sortowania będzie oparta na ekspresji CD45 i MHC klasy II oraz na braku ekspresji CD3, CD19, CD56, Ly6G, aby wykluczyć T, B, NK i neutrofile.

Resztki materiału nie będą składowane. Zakłada się, że pacjenci będą włączani i analizowani przez okres 5 lat.

Istnieje 5 różnych zadań:

Zadanie 1: Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki pojedynczych RNA-seq; Zadanie 2: Analiza bioinformatyczna sekwencji RNA pojedynczej komórki; Zadanie 3: Analiza metodą cytometrii przepływowej podtypów DC obecnych w mikrośrodowisku guza; Zadanie 4: Przestrzenne rozkłady podtypów DC w mikrośrodowisku guza Zadanie 5: Ocena związku pomiędzy podtypami komórek szpikowych obecnych w mikrośrodowisku guza a przeżywalnością;

Badanie zakończy się bioinformatyczną analizą danych i ich walidacją za pomocą analiz cytometrii przepływowej