Heterogenität dendritischer Zellen bei Dickdarm- und nichtkleinzelligem Lungenkrebs (TUM-DC)

HINTERGRUND Die Aktivierung adaptiver Immunantworten hängt von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen ab, myeloischen Zellen des angeborenen Immunsystems, die auf die Antigenpräsentation und die Aktivierung von T-Zellen spezialisiert sind. Diese Besonderheit myeloischer Zellen ist nicht nur bei infektiösen Krankheiten von grundlegender Bedeutung, sondern auch im Zusammenhang mit Krebs, da Phagozyten mit Krebszellen assoziierte Antigene aufnehmen und sie T-Zellen in der Mikroumgebung des Tumors oder in tumordrainierenden Lymphknoten präsentieren, um Antitumorreaktionen zu erzielen .

Insbesondere wurde eine positive Korrelation zwischen dem Gesamttumorgehalt an DC und dem Überleben von Krebspatienten mit unterschiedlichen Tumoren sowie eine bessere Reaktivität auf Therapien basierend auf dem Einsatz von Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICB) beobachtet.

Kürzlich wurde das Vorhandensein verschiedener Subtypen dendritischer Zellen sowie eine spezifische Anpassung jedes Subtyps an die Tumorumgebung entdeckt.

Dies ist ein kritischer Punkt, da die funktionelle Heterogenität von DCs, Makrophagen und T-Zellen in der Tumormikroumgebung wahrscheinlich einer der Faktoren ist, die für den Erfolg oder Misserfolg von Immuntherapien gegen Krebs verantwortlich sind. ICB-basierte Therapien haben die Behandlung von Krebspatienten wie Melanomen und Lungenkrebs revolutioniert, sind derzeit jedoch nur für eine Minderheit der Patienten von Nutzen. Ein besseres Verständnis der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems ist der Schlüssel zur Vorhersage klinischer Reaktionen auf bestehende Therapien und möglicherweise zur Entwicklung neuer Immuntherapien.

BEGRÜNDUNG Myeloidzellen wie dendritische Zellen und Makrophagen infiltrieren viele verschiedene Arten von Tumoren und können durch die Aktivierung von T- und NK-Zellen eine Antitumorfunktion ausüben, oder sie können durch die Produktion entzündungshemmender Zytokine und hemmender Moleküle eine protumorale Aktivität ausüben. Das Vorhandensein mehrerer konventioneller DC-Subtypen im Tumor wurde mit einer besseren Prognose in Verbindung gebracht, während für unkonventionelle DCs wie CD14 + CD1c + DC eine Protumorfunktion vorgeschlagen wurde. Das Vorhandensein von Makrophagen wurde mit einer protumoralen Wirkung in Verbindung gebracht.

Die Forscher nehmen an, dass die funktionelle Heterogenität von myeloischen Zellen und T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung einer der Faktoren ist, die für den Erfolg oder Misserfolg von Antitumor-Immunantworten verantwortlich sind. Die hochauflösende Definition myeloischer Zellsubtypen und tumorassoziierter T-Zellen, ihres Phänotyps, ihrer Verteilung innerhalb des Tumors sowie ihrer funktionellen Eigenschaften wird dazu beitragen, die Komplexität der Tumormikroumgebung zu verstehen.

STUDIENDESIGN Bei der Entnahme wird jede Probe identifiziert und mit einer eindeutigen ID versehen. Der Pathologe entnimmt dem Material eine Probe und wählt das Gewebe aus, das für das Experiment verwendet werden kann, nachdem er alles für die Diagnose benötigte Material entnommen hat. Die Forschungsprobe wird in Reagenzgläser gegeben und auf Eis aufbewahrt. Anschließend wird es an das Labor der Universität Mailand-Bicocca geschickt. Der Tumor wird in Stücke geschnitten und Einzelzellsuspensionen werden mit dem humanen Tumordissoziationskit und dem gentleMACS™-Dissoziator (Miltenyi Biotech) gemäß dem Standardprotokoll hergestellt. Zellsuspensionen werden dann durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert.

Die Forscher werden ungefähr 60 Patienten für Immunfluoreszenzstudien und 4 Patienten für transkriptomische Einzelzellanalysen (Einzelzell-RNA-Sequenz) analysieren. Die Einzelzellanalyse von vier Patienten hat sich bereits als ausreichend erwiesen, um verschiedene Subtypen von Immunzellen zu identifizieren. Immunzellen werden behandelt, um eine mit myeloischen Zellen angereicherte Zellsuspension zu erhalten. Dies ermöglicht eine genaue Analyse der Subtypen von DC, Makrophagen und CD4 + T-Zellen und ermöglicht die Identifizierung selbst sehr seltener Populationen, die aufgrund der Verdünnung in unselektierten Proben verloren gehen könnten. Die Vorsortierungsstrategie basiert auf der Expression von CD45 und MHC Klasse II sowie auf der Abwesenheit der Expression von CD3, CD19, CD56 und Ly6G, um T, B, NK und Neutrophile auszuschließen.

Restmaterial wird nicht eingelagert. Es wird davon ausgegangen, dass die Patienten über einen Zeitraum von 5 Jahren aufgenommen und analysiert werden.

Es gibt 5 verschiedene Aufgaben:

Aufgabe 1: Vorbereitung und Sequenzierung der Einzelzell-RNA-Seq-Bibliothek; Aufgabe 2: Einzelzell-RNA-seq-Bioinformatikanalyse; Aufgabe 3: Durchflusszytometrische Analyse der in der Tumormikroumgebung vorhandenen DC-Subtypen; Aufgabe 4: Räumliche Verteilungen von DC-Subtypen in der Tumormikroumgebung. Aufgabe 5: Bewertung des Zusammenhangs zwischen Subtypen myeloischer Zellen, die in der Tumormikroumgebung vorhanden sind, und dem Überleben.

Die Studie endet mit der bioinformatischen Analyse der Daten und deren Validierung durch durchflusszytometrische Analysen