Uma abordagem de célula única para identificar biomarcadores de toxicidade pulmonar para bloqueio de ponto de controle imunológico

Os investigadores aplicarão o sequenciamento de RNA e TCR de célula única em até 5.000 células individuais por amostra. Além disso, a expressão da proteína da superfície celular pode ser integrada com a informação transcricional. Vários pipelines de bioinformática, incluindo Seurat, serão usados ​​para identificar diferentes clusters de células, que através da expressão de genes marcadores serão atribuídos a tipos de células conhecidas, subtipos celulares ou fenótipos. Por exemplo, isso tornará possível monitorar a abundância de células T que expressam PD-1/PD-L1, células T citotóxicas, células mieloides imunossupressoras, etc. Os seguintes parâmetros em nível de célula única serão relevantes, entre outros:

• A composição e abundâncias relativas de tipos de células imunes estabelecidas (por exemplo, células T (CD4+, CD8+ e subconjuntos regulatórios), células NK, células B, MDSCs, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas). Dados transcriptômicos para cada um desses subtipos de células imunes serão analisados, permitindo a caracterização de programas específicos de expressão gênica que definem estados fenotípicos específicos.
• Composição de todos os subtipos celulares estromais identificados por transcriptômica de célula única.
• Uma rede reguladora de genes para cada tipo de célula e subtipo celular (ou estado celular) será estabelecida e os principais reguladores da transcrição serão identificados. Células T individuais e subgrupos de células T serão classificados com base na ativação do interferon, altas taxas de proliferação e transcrição e aumento da expressão de granzimas, que são todos indicativos de ativação de células T.

As amostras de sangue serão submetidas a procedimentos experimentais de célula única semelhantes. Primeiro, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são isoladas usando centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. A análise de transcriptoma de célula única em combinação com CITE-seq será realizada em 5000 PBMC. A composição celular será determinada usando os mesmos pipelines de bioinformática usados ​​para processar as células do fluido BAL.