En encellig metod för att identifiera biomarkörer för lungtoxicitet för immunkontrollpunktsblockad

Utredarna kommer att tillämpa encells RNA- och TCR-sekvensering på upp till 5 000 enstaka celler per prov. Dessutom kan cellytproteinexpression integreras med transkriptionsinformationen. Olika bioinformatikpipelines, inklusive Seurat, kommer att användas för att identifiera olika cellkluster, som genom markörgenuttryck kommer att tilldelas kända celltyper, cellulära subtyper eller fenotyper. Detta kommer till exempel att göra det möjligt att övervaka mängden PD-1/PD-L1-uttryckande T-celler, cytotoxiska T-celler, immunsuppressiva myeloidceller etc. Följande parametrar på encellsnivå kommer att vara relevanta, bland annat:

• Sammansättningen och relativa överflöd av etablerade immuncelltyper (t.ex. T-celler (CD4+, CD8+ och regulatoriska undergrupper), NK-celler, B-celler, MDSC:er, makrofager, neutrofiler, dendritiska celler). Transkriptomiska data för var och en av dessa immuncellssubtyper kommer att analyseras, vilket möjliggör karakterisering av specifika genuttrycksprogram som definierar specifika fenotypiska tillstånd.
• Sammansättning av alla stromala cellulära subtyper identifierade med enkelcellstranskriptomik.
• Ett genreglerande nätverk för varje celltyp och cellulär subtyp (eller celltillstånd) kommer att upprättas och master transkriptionella regulatorer kommer att identifieras. Individuella T-celler och T-cellssubkluster kommer att klassificeras baserat på interferonaktivering, höga proliferations- och transkriptionshastigheter och ökat granzymexpression, vilket alla är indikativt för T-cellsaktivering.

Blodprover kommer att utsättas för liknande encelliga experimentella procedurer. Först isoleras perifera mononukleära blodceller (PBMC) med användning av Ficoll-densitetsgradientcentrifugering. Encellstranskriptomanalys i kombination med CITE-seq kommer att utföras på 5000 PBMC. Cellsammansättningen kommer att bestämmas med hjälp av samma bioinformatiska pipelines som används för bearbetning av BAL-vätskecellerna.