Desenvolvimento da microbiota intestinal em bebês prematuros e transplante fecal materno (PREFLOR)

No Departamento de Obstetrícia do Hospital Universitário de Helsinque, recrutaremos 36 mulheres grávidas (permitindo a positividade da triagem) entre 29 e 34 semanas de gravidez, por exemplo, com pré-eclâmpsia ou insuficiência cervical, mas que sejam saudáveis. A amostra fecal da mãe é cuidadosamente examinada em caso de doenças contagiosas. Nosso objetivo é recrutar 18 mães com amostras de triagem negativas.

Os bebês nascem na semana gestacional 30-35 por via vaginal ou por CS. Grupo A (grupo de estudo): 10 prematuros nascidos por SC. Esses bebês receberão um FMT materno, que será administrado quando tolerarem leite 40 mL/dia. Grupo B (grupo de comparação): 8 bebés prematuros de mães negativas no rastreio e 4 bebés de mães que tiveram um resultado positivo nas amostras de rastreio (no caso de o resultado positivo ser um agente patogénico ligeiro, por ex. Dientamoeba fragilis ou Blastocystis hominis) nascido por CS. No caso de tratamento antibiótico da criança, o transplante não é realizado antes de 48 horas após a última dose, mas não depois dos 7 dias de idade. Grupo C: Grupo de comparação de bebês prematuros nascidos de parto normal com 30-35 semanas de gestação. Para o grupo de comparação, apenas amostras fecais são obtidas como nos demais grupos.

Para o grupo A, as amostras de sangue são coletadas no dia do transplante e 1 e 3 dias depois. As amostras são as mesmas do ensaio principal SECFLOR: amostras de pesquisa e avaliação de marcadores inflamatórios de rotina (como hemograma e PCR).

Do grupo de comparação (B), amostras de PCR e hemograma são coletadas conforme solicitado pelo médico assistente. Para avaliar os marcadores imunológicos, uma amostra de 1 mL é coletada aos 5-7 dias de idade, concomitantemente com amostras de sangue solicitadas pelo médico assistente. Nenhuma amostra adicional é coletada do grupo de parto vaginal.

De todos os grupos: é coletada uma amostra de mecônio e, em seguida, uma amostra de fezes no dia do transplante, e dois dias após e a partir de 1 semana de idade, semanalmente até a idade de 4 semanas ou até a alta da unidade intensiva. Após a alta, os pais coletarão uma amostra de fezes da criança aos 3, 6, 9 e 12 meses.

Amostras de sangue de 1-3mL de todos os bebês nascidos por SC (grupo A e B) são coletadas aos três e seis meses de idade para avaliar o imunodesenvolvimento.

Métodos Amostras fecais: As mães são solicitadas a fornecer uma amostra de fezes frescas entre 29 e 34 semanas. Este é processado para isolamento de DNA e armazenado em solução salina e glicerol. Um kit de amostragem de fezes domiciliar é fornecido para coletar amostras de fezes de mães e bebês em fraldas. A microbiota intestinal de mães e bebês é determinada usando análise baseada em 16S rRNA usando sequenciamento de próxima geração. O DNA fecal é extraído por batimento repetido de esferas e processado para sequenciamento usando primers pré-definidos. Extrações de DNA e execuções de MiSeq incluem amostras de referência internas e uma comunidade simulada. A análise metagenômica será conduzida essencialmente. Os genes de resistência serão caracterizados pelo mapeamento de leituras metagenômicas de nucleotídeo a nucleotídeo nos bancos de dados CARD e Resfinder para pesquisar genes de resistência a antibióticos (ARGs) adquiridos.

Amostras de sangue: O desenvolvimento de todas as principais populações de células imunológicas é analisado por citometria de massa e 267 proteínas plasmáticas por imunoensaios. Cerca de 100 ul de sangue total são coletados para análise de citometria de massa e misturados com Cytodelics Whole Blood Cell Stabilizer na proporção de 1:1, incubados em temperatura ambiente por 10 minutos e transferidos para um freezer a 80°C para armazenamento de longo prazo aguardando análise. Amostras de plasma são obtidas, PBMCs são isoladas usando separação baseada em gradiente de densidade.