Desarrollo de la microbiota intestinal del lactante prematuro y trasplante fecal materno (PREFLOR)

En el Departamento de Obstetricia del Hospital Universitario de Helsinki reclutaremos a 36 mujeres embarazadas (teniendo en cuenta la positividad del cribado) entre 29 y 34 semanas de embarazo con, por ejemplo, preeclampsia o insuficiencia cervical, pero que por lo demás estén sanas. La muestra fecal de la madre se analiza cuidadosamente en caso de enfermedades contagiosas. Nuestro objetivo es reclutar a 18 madres con muestras de detección negativas.

Los bebés nacen en la semana de gestación 30-35, ya sea por vía vaginal o por cesárea. Grupo A (grupo de estudio): 10 recién nacidos prematuros nacidos por cesárea. Estos bebés recibirán un FMT materno, que se administrará cuando toleren 40 ml de leche al día. Grupo B (grupo de comparación): 8 bebés prematuros de madres con resultados negativos y 4 bebés de madres que tienen un resultado positivo en las muestras de análisis (en caso de que el resultado positivo sea un patógeno leve, p. ej. Dientamoeba fragilis o Blastocystis hominis) nacido por CS. En caso de tratamiento con antibióticos del bebé, el trasplante se realiza no antes de las 48 horas después de la última dosis, pero no después de los 7 días de edad. Grupo C: Grupo de comparación de recién nacidos prematuros nacidos por vía vaginal entre 30 y 35 semanas de gestación. Para el grupo de comparación, solo se obtienen muestras fecales como en los otros grupos.

Para el grupo A, las muestras de sangre se toman el día del trasplante y 1 y 3 días después. Las muestras son las mismas que en el ensayo principal de SECFLOR: muestras de investigación y evaluación de marcadores inflamatorios de rutina (como CBC y CRP).

Del grupo de comparación (B) se toman muestras de PCR y hemograma según lo ordenado por el médico tratante. Para evaluar marcadores inmunológicos se toma una muestra de 1 mL a los 5-7 días de edad de forma concomitante con muestras de sangre ordenadas por el médico tratante. No se toman muestras adicionales del grupo de parto vaginal.

De todos los grupos: Se recolecta muestra de meconio y luego muestra de heces el día del trasplante, y dos días después y a partir de 1 semana de edad semanalmente hasta las 4 semanas de edad o hasta el alta de la unidad intensiva. Después del alta, los padres recolectarán una muestra de heces del niño a las edades de 3, 6, 9 y 12 meses.

Se toman muestras de sangre de 1 a 3 ml de todos los bebés nacidos mediante CS (grupos A y B) a la edad de tres y seis meses para evaluar el desarrollo inmunológico.

Métodos Muestras fecales: se pide a las madres que proporcionen una muestra de heces frescas entre las semanas 29 y 34. Esto se procesa para el aislamiento del ADN y se almacena en solución salina y glicerol. Se proporciona un kit de muestreo de heces en el hogar para tomar muestras de las heces de las madres y de los bebés en los pañales. La microbiota intestinal de madres y bebés se determina mediante análisis basado en ARNr 16S mediante secuenciación de próxima generación. El ADN fecal se extrae mediante repetidos golpes de perlas y se procesa para su secuenciación utilizando cebadores predefinidos. Las extracciones de ADN y las ejecuciones de MiSeq incluyen muestras de referencia internas y una comunidad simulada. Se realizará esencialmente un análisis metagenómico. Los genes de resistencia se caracterizarán mapeando lecturas metagenómicas de nucleótido a nucleótido en las bases de datos CARD y Resfinder para buscar genes de resistencia a antibióticos (ARG) adquiridos.

Muestras de sangre: el desarrollo de todas las principales poblaciones de células inmunitarias se analiza mediante citometría masiva y 267 proteínas plasmáticas mediante inmunoensayos. Se recolectan aproximadamente 100 ul de sangre entera para análisis de citometría masiva y se mezclan con el estabilizador de células de sangre entera Cytodelics en una proporción de 1:1, se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos y se transfieren a un congelador a 80 °C para su almacenamiento a largo plazo en espera de análisis. Se obtienen muestras de plasma y las PBMC se aíslan mediante separación basada en gradiente de densidad.