牙釉质基质蛋白治疗侵袭性和慢性牙周炎患者的骨内缺损

总体工作计划和实验方法

1. 样本选择

   在向 Piracicaba 牙科学校 - UNICAMP 的研究伦理委员会 (CEP) 提交并批准该项目后，将在研究生 FOP-UNICAMP 诊所寻求自发治疗的患者中进行选择（也将在临床阶段进行研究），45 名患者符合纳入标准

2. 抽样微积分

   考虑到临床依恋水平 (CAL) 作为主要变量，计算了每组所需的样本量。 考虑到 1 mm 误差的标准偏差和 80% 的检验能力，要检测组间 1 mm 和 5% alpha 的差异，每组至少需要 12 名患者。 考虑到部分患者在随访过程中可能会失访，本研究将纳入15例患者。

3. 随机化和盲法

   检查者将对治疗视而不见。 这是通过确定评估是由不参与治疗的专业人员进行的来实现的。 将患者分成一组应该通过抽签来完成，以成为一个完全随机的样本，治疗随机分配给患者。 在手术过程中，将使用棕色信封，其中包含通过计算机化系统生成的治疗组信息。

4. 学习规划

   将对 45 名患者进行为期一年的平行研究。 被选中的患者将被分为 3 组，他们的牙齿将接受建议的治疗，具体如下：

   • GAP 手术通路组（GAP + OFD，15 名患者）- 被诊断患有广泛性侵袭性牙周炎 (PAG) 的患者，其中先前选择的骨内缺损将接受开放瓣清创术。
   • GAP Surgical Access + EMD 组（GAP + OFD/EMD，15 名患者）- 诊断为全身性侵袭性牙周炎 (PAG) 的患者，其中先前选择的骨内缺损将接受开放瓣清创术，此外还应用 EMD在缺陷中。
   • Group GCP Surgical Access + EMD（GCP + OFD/EMD，15 名患者）- 诊断为广泛性慢性牙周炎 (PCG) 的患者，其中先前选择的骨内缺损将接受开放瓣清创术，此外还应用 EMD在缺陷中。

5. 术前阶段

   初始检查：根据预先制定的标准选择患者。

   初始治疗：将对所有患者进行有关牙周病的原因和后果以及预防技术的教育，包括牙龈刷牙和使用牙线的技术。 将为个人提供软刷和含氟牙膏，并根据需要补充。 如有必要，将进行专业去除生物膜和龈上牙石，以及生物膜保留因素。

   治疗：对所有存在适应症的牙齿进行刮治和根面平整。 在治疗的积极阶段之后，患者将被纳入支持治疗，在第一个月和每月进行一次控制，直到研究结束，包括卫生指导、预防和每季度对探诊深度大于的牙齿进行再治疗5 毫米，带 BoP。

6. 手术阶段

   根据上述纳入标准，存在残余探诊深度 ≥ 6mm 并伴有牙槽骨缺损放射学证据的牙齿将被纳入手术程序。 只有当所有必要的非手术程序都伴随着足够的 PI 和 GI 水平高达 20% 时，才会安排再生程序。 所有外科手术将由同一操作员执行。 治疗前一小时，患者将接受单剂量的地塞米松 4mg。

   技术描述： 局部麻醉后，将升起全层皮瓣以接触所有缺损面。 沟槽切口将延伸至近中和远中相邻牙齿，包括皮瓣中的整个乳头。 不会进行松弛切口。 然后小心去除所有肉芽组织，随后进行刮治和根面平整。 手术区域将用 0.9% 盐水冲洗并仔细检查，以确保在此之前所有步骤都已令人满意地执行。 在外科手术的这个初始阶段之后，缺陷将被随机化。 对于GAP+OFD/EMD和GCP+OFD/EMD组，在缺陷中会有EMD的应用。 为此，所讨论的表面应该没有唾液和血液。 该物质将立即应用于暴露的牙根表面。 应用将从骨水平的最顶端部分开始，直到完全覆盖缺损和牙根表面。 然后将皮瓣重新定位并被动缝合，直到组织初步闭合。

   术后护理：将指导患者服用止痛药（安乃近钠 500mg，每 4 小时一次，持续 2 天）和螯合剂 0.12% 氯己定二葡萄糖酸盐（每天 2 次，持续 15 天）。 缝合线将在手术后 15 天后拆除。 在术后期间，将要求患者在手术区域停止刷牙和使用牙线 15 天，届时将恢复口腔卫生习惯。

7. 临床评估

   将对检查者进行测量的预校准，以确保通过两次检查获得的数据的可靠性，两次检查之间的最大间隔为 48 小时，针对 8 名不同的非研究患者。 Kappa 指数和类内相关性将用于评估再现性和一致性。

   所有临床参数将使用北卡罗来纳型牙周探针在基线、3、6 个月和此后 1 年时获得，并借助于由检查者预先形成的研究模型制成的支架/单独的丙烯酸导向器。

   评估的临床参数将是： 板指数 - PI；探诊出血 - BoP；龈缘位置——GMP：支架到游离龈缘的距离；相对临床附着水平 - rCAL：从支架到牙周袋临床可检测底部的距离；探诊深度 - PD (rCAL - GMP)：从牙龈边缘到临床可检测的牙周袋底部的距离。

   在经手术时，将进行以下测量： 支架边缘与牙槽骨嵴之间的距离 (BC-ST)；牙槽骨嵴与缺损基部之间的距离 (BC-BD)，表征骨内缺损的垂直分量；从牙槽骨嵴到根面的距离 (BC-RS)，表征缺损的水平分量。

8. 患者满意度和对治疗的看法

   为了评估患者对所执行手术和术后时间的看法，他们将在手术后 15 天收到一份问卷。 将使用 100mm 水平模拟视觉量表 (VAS) 评估在手术期间经历的不适和/或疼痛的程度，范围从没有到极度。 还将指示患者量化所用镇痛药的量。 此外，术后第一周的不适、根性过敏、水肿、血肿、发热和干扰日常活动的程度将以同样的方式进行评估。 外科手术 6 个月后，将发送另一份问卷，以确定个人对结果的看法和对治疗的满意度。 调查问卷将使用简化的量表，通过选择以下一项来记录治疗牙齿美学外观方面的治疗满意度：非常满意、中立、中等满意或不满意。 此外，将询问患者对应用于相关牙齿的治疗结果的看法，包括牙龈出血、发红、水肿和卫生模式的改善。 这些参数也将通过 VAS 量表进行评估，0 表示没有改善，100 表示最大改善。 口腔健康影响概况 14 (OHIP-14) 也将用于获得与口腔健康相关的生活质量，应用于术前和 6 个月后。 影响的维度是：功能受限、身体疼痛、心理不适、身体丧失能力、心理丧失能力和无法进行日常活动。 术后患者满意度问卷 (PSPSQ) 的改编版也将用于评估患者在术后 15 天和 6 个月期间对手术过程的满意度。 该 3 项量表的响应从 0 到 10（0 = 不在 10 = 完全），能够评估患者在术后期间的短期和长期满意度。

9. 射线照相评估[

   所有骨内缺损的根尖周 X 光片将在基线、6 个月和 1 年后由同一位检查者使用平行技术进行。 为了图像的标准化，将使用射线照相定位器在化学活化的丙烯酸树脂中进行咬合记录。 将已知尺寸的标准正畸金属丝放置在特定位置的咬合支架上，并在 X 光片上获取该金属丝的图像，以在分析期间校正垂直和水平角度。

   X 射线将由使用灵活且可重复使用的荧光粉存储板（PSP；31 毫米 x 41 毫米）的数字系统执行。 曝光时间的选择将根据与缺陷相关的牙齿进行，因为要使用的设备（移动柱的 Sommo X 射线，管：70 kV，7 mA，焦距：20 cm，规格：800- 1200 VA，50-60 Hz；具有半自动牙齿选择系统，曝光时间范围为 0.32 至 0.40 秒。 为了读取图像，将使用特定的扫描仪。 获得的图像将存储在计算机中，直到进行分析。 默认分辨率为 96x96 dpi 和 32 位。 所有图像都将以 TIFF (.tif) 格式记录。 缺陷的射线照相测量将使用特定的图像分析软件进行。 缺陷的射线照相角度将由代表牙根表面和骨缺损表面的两条线进行评估和定义。

   将测量以下线性射线照相参数： 到缺损基部 (BD) (CEJ-BD) 的牙釉质接合部距离 (CEJ)；距 CEJ 和牙槽骨嵴 (BC) 更冠状部分的距离 (CEJ-BC)； BD 和 BC (BD-BC) 之间的距离。 术后 6 个月和 1 年发现的值与 CEJ-BD 基线之间的差异将表明骨下缺损的硬组织填充量。 CEJ-BC 和 BD-BC 之间的差异将分别确定骨嵴的吸收量和骨内缺损的深度

10. 微生物评价

    微生物学评估将通过实时型聚合酶链式反应 (PCR) 进行。 该测试将允许对以下细菌进行定量检测：P. gingivalis、T. forsythia、A. actinomycetemcomitans、P. micro 和 P. intermedia。

    龈下生物膜样本将在基线、手术后 3、6 个月和 1 年由同一名检查员进行。 为此，将使用先前为手术阶段选择的牙齿和面部。 该区域将用经过消毒的棉卷适当地绝缘。 生物膜的龈上部分将被去除，然后通过将无菌吸水纸锥放入袋中来获取龈下生物膜的样本。 30 秒后，纸锥将被取出并放入装有 Tris-EDTA 溶液的微型离心管中，为每位患者编码。 eppendorfs 应保持在-20°C，直到进行测试。

    对于 DNA 提取，将涡旋微管并在临床夹钳辅助下取出纸锥。 将样品离心以除去上清液。 加入 700 µL 提取缓冲液，进一步摇匀，置于 65°C 水浴中 30 分钟。下一步将加入 650 µl CIA，均质成乳液（20 次），12,000-15,000 rpm 离心7分钟。 将水相转移到新的 1.5 mL 微管中，向其中添加 200 µL 不含蛋白酶 K 的提取缓冲液。 然后将进行均质化以添加 650 µL CIA。 进一步匀化并在 12,000-15,000 rpm 下继续离心 7 分钟。 将水相转移到新管中，向其中加入 650 μl CIA，然后以 12,000-15,000 rpm 离心 7 分钟（如果需要，再重复两次）。 DNA 将在室温下用 1 体积的异丙醇沉淀，然后匀浆（20 次）并以 12,000-15,000 rpm 离心 7 分钟。 沉淀物表面用临用前配制的50 μl 70%乙醇洗涤一次，离心2分钟。 应干燥沉淀物，将管子打开放在布森喷嘴旁边的工作台上。 然后，在 40 μL TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，pH 8.0）+ 10 μg/mL RNAse 中进行重悬，并在 37°C 的水浴中放置 30 分钟。 5 μL 样品将用于检查质量并估计 0.8-1.0% 中的 DNA 量 琼脂糖凝胶。 已知质量标准 (pGEM) 将一起运行。

    引物的实时PCR绘图：将使用牙龈卟啉单胞菌、连翘坦纳氏菌、微单胞菌、中间普氏菌和伴放线放线菌的特异性引物。 所有引物都将通过检查熔解曲线（在 LightCycler 中运行后获得）和运行凝胶来检查特异性，以进行产品验证。

    反应优化：使用 SYBR Green I 需要特定的 PCR 产物，以便在反应本身开始之前优化引物反应的有效性。 浓度范围为 2 至 5 mM MgCl2 和 0.2 至 0.5 μM 的每种引物将用于确定在什么条件下反应将具有最佳效率。 设备制造商建议的条件。

    RT-PCR 反应：RT-PCR 反应将通过使用 FastStart DNA Master SYBR Green I 试剂盒的 LightCycler 系统进行。 反应曲线将根据设备制造商的建议确定。 对于每次“运行”，水将用作阴性对照，反应产物将使用制造商自己的程序进行量化。

11. 免疫酶测试（Luminex 平台/MAGpix）

    牙龈缝液 (GCF) 收集将在基线、研究后 15 天、45 天、3 个月、6 个月和 1 年由同一位检查员进行。 为此，将使用先前为手术阶段选择的牙齿和面部。 材料采集过程中，对相关部位进行适当保温，并用消毒棉卷擦干。 通过将纸条置于牙齿/牙周组织界面内 30 秒，去除细菌生物膜的龈上部分以获得 GCF 样品。 每个位点使用两条纸条以获得合适的纸条，然后将纸条放入微量离心管中，用 150 μl 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和 0.05% Tween-20 对每个个体和实验期进行编码。 样品将被储存以供进一步分析。

    在分析之前，流体样品将在 Millipore 试剂盒中的 60μl 缓冲液中稀释，涡旋 30 分钟，然后以 10,000 rpm 离心 10 分钟。 将分析每个 GCF 样品的等分试样，以通过 Luminex / MAGpix 技术检测骨标记物（PDGF、VEGF、FGF、OPG、OCN、OPN、TGFα、PTH 和 RANKL）。 为此，将按照制造商的说明，借助高灵敏度面板在 96 孔板中进行分析。 简而言之，孔将用洗涤缓冲液洗涤并吸出。 与针对待分析的不同分析物的单克隆抗体偶联的独家微球将被添加到孔中（聚苯乙烯微球用精确比例的两种荧光团染色，创建“颜色代码”以供 Luminex / MAGpix 仪器进一步识别）。 将用于标准曲线的样品和试剂移入孔中并在 4oC 下孵育过夜。 然后清洗孔并加入二抗混合物。 孵育 1 小时后，将通过与检测抗体结合的第三种荧光标记链霉亲和素-藻红蛋白 (PE) 进行最终检测。 Luminex / MAGpix 设备将通过流式细胞仪上的两种不同激光束以单行方式移动这些珠子。 第一束激光将检测（分类）微球（测试的颜色代码），第二束激光将量化每个微球中的报告信号。 样品将被单独分析，它们的浓度将使用 Xponent 软件使用多项式方程从标准曲线估计。 每个标记的平均浓度将以 pg / μl 表示。 定量低于分析检测限的样品应记录为“零”，高于标准曲线定量限的样品应记录为等于曲线的最高值。

12. 结果分析 将使用包含绝对和相对频率以及均值和标准差参数的表格和图表，通过描述性统计对结果进行分析。 定量变量的比较将通过方差分析和 Tukey 检验来完成。 定性变量将使用卡方检验进行比较。 变量之间的相关性检查将通过 Pearson 和 Spearman 相关系数来完成。 在所有测试中，将采用5%的显着性水平。