Białka macierzy szkliwa w leczeniu ubytków wewnątrzkostnych u pacjentów z agresywnym i przewlekłym zapaleniem przyzębia

Ogólny plan pracy i metodyka eksperymentu

1. Wybór próbek

   Po złożeniu i zatwierdzeniu tego projektu do Komisji Etyki Badań Naukowych (CEP) Szkoły Stomatologicznej Piracicaba – UNICAMP, zostanie wybrany spośród pacjentów zgłaszających się spontanicznie na leczenie w klinikach po ukończeniu FOP-UNICAMP (gdzie również zostanie przeprowadzona faza kliniczna badania), 45 pacjentów zgodnie z kryteriami włączenia

2. Rachunek próbkowania

   Wielkość próby wymagana dla każdej grupy została obliczona z uwzględnieniem klinicznego poziomu przywiązania (CAL) jako głównej zmiennej. Aby wykryć różnicę 1 mm przy 5% alfa między grupami, biorąc pod uwagę odchylenie standardowe 1 mm błędu i 80% mocy testu, potrzebnych będzie co najmniej 12 pacjentów w każdej grupie. Biorąc pod uwagę, że niektórzy pacjenci mogą zostać utraconi podczas obserwacji, 15 pacjentów zostanie włączonych do niniejszego badania.

3. Randomizacja i zaślepienie

   Egzaminator będzie ślepy na zabiegi. Osiąga się to poprzez ustalenie, że ocen dokonuje profesjonalista niezaangażowany w leczenie. Podział pacjentów na grupy powinien być dokonany w drodze losowania, aby stanowić całkowicie losową próbę, przy czym leczenie powinno być losowo rozdzielane między pacjentów. Podczas zabiegu chirurgicznego będą używane brązowe koperty zawierające informacje z grupy leczonej, które zostały wygenerowane przez system komputerowy.

4. Projekt badania

   Równoległe badanie zostanie przeprowadzone na 45 pacjentach i potrwa rok. Wybrani pacjenci zostaną podzieleni na 3 grupy, których zęby zostaną poddane proponowanym zabiegom w następujący sposób:

   • Grupa dostępu chirurgicznego GAP (GAP + OFD, 15 pacjentów) - Pacjenci z rozpoznaniem uogólnionego agresywnego zapalenia przyzębia (PAG), u którego otrzymany zostanie wcześniej wybrany ubytek wewnątrzkostny otrzymają oczyszczenie otwartego płata.
   • Grupa GAP Dostęp chirurgiczny + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 pacjentów) - Pacjenci z rozpoznaniem uogólnionego agresywnego zapalenia przyzębia (PAG), u którego wcześniej wybrany ubytek wewnątrzkostny zostanie oczyszczony z otwartego płata i dodatkowo z zastosowaniem EMD w usterce.
   • Grupa GCP Dostęp chirurgiczny + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 pacjentów) - Pacjenci z rozpoznaniem uogólnionego przewlekłego zapalenia przyzębia (PCG), u którego wcześniej wybrany ubytek wewnątrzkostny zostanie oczyszczony z otwartego płata i dodatkowo z zastosowaniem EMD w usterce.

5. Faza przedoperacyjna

   Badanie wstępne: Selekcja pacjentów według wcześniej ustalonych kryteriów.

   Terapia wstępna: Wszyscy pacjenci zostaną poinformowani o przyczynach i konsekwencjach chorób przyzębia oraz o technikach profilaktycznych, w tym o technice szczotkowania dziąseł i nitkowania zębów. Osoby otrzymają miękkie szczoteczki w połączeniu z pastą do zębów z fluorem, która będzie uzupełniana w razie potrzeby. Wykonane zostanie profesjonalne usunięcie biofilmu i kamienia nazębnego naddziąsłowego oraz w razie potrzeby czynniki retencji biofilmu.

   Leczenie: Skaling i wygładzenie korzeni wszystkich zębów, które stanowią wskazanie. Po aktywnej fazie leczenia pacjenci zostaną objęci terapią wspomagającą z dwutygodniową kontrolą w pierwszym miesiącu i co miesiąc do końca badania, obejmującą orientację higieniczną, profilaktykę i cokwartalne ponowne leczenie zębów, które mają głębokość sondowania większą niż 5 mm, z BoP.

6. Faza chirurgiczna

   Zęby, które wykazują szczątkową głębokość sondowania ≥ 6 mm związaną z radiograficznymi objawami ubytków wewnątrzzębowych, zgodnie z kryteriami włączenia wymienionymi powyżej, zostaną włączone do zabiegu chirurgicznego. Procedury regeneracyjne zostaną zaplanowane tylko wtedy, gdy wszystkie niezbędne procedury niechirurgiczne zostaną wykonane przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniego poziomu PI i GI do 20%. Wszystkie zabiegi chirurgiczne będą wykonywane przez tego samego operatora. Na godzinę przed terapią pacjenci otrzymają pojedynczą dawkę 4 mg deksametazonu.

   Opis techniki: Po podaniu środków miejscowo znieczulających zostaną podniesione płaty pełnej grubości w celu uzyskania dostępu do wszystkich powierzchni ubytku. Wykonane zostaną nacięcia dziąsłowe rozciągające się na sąsiednie zęby mezjalne i dystalne, w tym całą brodawkę w płacie. Nie będą wykonywane żadne nacięcia relaksacyjne. Cała tkanka ziarninowa zostanie następnie ostrożnie usunięta, a następnie przeprowadzone zostanie skaling i wygładzenie korzeni. Pole operacyjne zostanie przepłukane 0,9% roztworem soli fizjologicznej i dokładnie sprawdzone, aby upewnić się, że do tego czasu wszystkie czynności zostały wykonane w sposób zadowalający. Po tej początkowej fazie zabiegu chirurgicznego wady będą losowane. W przypadku grup GAP + OFD/EMD i GCP + OFD/EMD w usterce będzie zastosowanie EMD. W tym celu dana powierzchnia powinna być wolna od śliny i krwi. Substancja ta zostanie natychmiast nałożona na odsłoniętą powierzchnię korzenia. Aplikacja rozpocznie się od najbardziej wierzchołkowej części kości, aż do całkowitego pokrycia ubytku i powierzchni korzenia. Płaty zostaną następnie przesunięte i zszyte biernie, aż do pierwotnego zamknięcia tkanek.

   Opieka pooperacyjna: Pacjenci zostaną poinstruowani, aby przyjmować środki przeciwbólowe (dipiron sodowy 500 mg co 4 godziny przez 2 dni) oraz chelat 0,12% diglukonianu chlorheksydyny (2 razy dziennie przez 15 dni). Szwy zostaną zdjęte po 15 dniach od zabiegu. W okresie pooperacyjnym pacjent zostanie poproszony o zaprzestanie szczotkowania i nitkowania w okolicy zabiegowej przez 15 dni, kiedy to zostaną przywrócone nawyki higieniczne jamy ustnej.

7. Ocena kliniczna

   Wstępna kalibracja aparatu do pomiarów zostanie przeprowadzona w celu zapewnienia wiarygodności danych uzyskanych podczas dwóch badań, w odstępie maksymalnie 48 godzin, u 8 różnych pacjentów niebędących uczestnikami badań. Wskaźnik Kappa i korelacja wewnątrzklasowa zostaną wykorzystane do oceny odtwarzalności i zgodności.

   Wszystkie parametry kliniczne zostaną uzyskane za pomocą sondy periodontologicznej typu North Carolina, na początku, 3, 6 miesięcy i 1 rok później, za pomocą stentów/indywidualnych prowadnic akrylowych, wykonanych z wstępnie uformowanych modeli badawczych przez egzaminatora.

   Ocenianymi parametrami klinicznymi będą: wskaźnik płytkowy – PI; Krwawienie przy sondowaniu - BoP; Pozycja brzegu dziąsła - GMP: odległość od stentu do wolnego brzegu dziąsła; Względny poziom przyczepu klinicznego — rCAL: odległość od stentu do wykrywalnej klinicznie podstawy kieszonki przyzębnej; Głębokość sondowania — PD (rCAL — GMP): odległość od brzegu dziąsła do klinicznie wykrywalnej podstawy kieszonki przyzębnej.

   W czasie przezoperacyjnym zostaną wykonane następujące pomiary: Odległość między brzegiem stentu a grzebieniem kości wyrostka zębodołowego (BC-ST); Odległość między grzebieniem kości wyrostka zębodołowego a podstawą ubytku (BC-BD), charakteryzująca pionową składową ubytku wewnątrzkostnego; Odległość od grzebienia kości wyrostka zębodołowego do powierzchni korzenia (BC-RS), charakteryzująca poziomą składową ubytku.

8. Zadowolenie pacjenta a postrzeganie terapii

   W celu oceny percepcji wykonanego zabiegu i okresu pooperacyjnego pacjent otrzyma ankietę po 15 dniach od zabiegu. Stopień dyskomfortu i/lub bólu odczuwanego w okresie międzyoperacyjnym zostanie oceniony przy użyciu poziomej analogowej skali wizualnej (VAS) o długości 100 mm, od braku do skrajności. Pacjenci zostaną również poinstruowani, aby określić ilość użytego środka przeciwbólowego. Ponadto w ten sam sposób oceniany będzie stopień dyskomfortu, nadwrażliwość korzeni, obrzęk, krwiak, gorączka oraz zakłócenie codziennych czynności w pierwszym tygodniu po operacji. Po 6 miesiącach od zabiegu chirurgicznego zostanie dostarczona kolejna ankieta, której celem będzie określenie postrzegania efektów i stopnia zadowolenia z przeprowadzonego leczenia. Kwestionariusz użyje uproszczonej skali do odnotowania satysfakcji z leczenia pod względem estetycznego wyglądu leczonego zęba, wybierając jedną z następujących opcji: bardzo zadowolony, neutralny, średnio zadowolony lub niezadowolony. Dodatkowo pacjenci zostaną zapytani o ich opinie na temat wyników terapii zastosowanych na danych zębach pod kątem poprawy krwawienia dziąseł, zaczerwienienia, obrzęku oraz wzorca higieny. Parametry te będą również oceniane za pomocą skali VAS, gdzie 0 oznacza brak poprawy, a 100 oznacza maksymalną poprawę. Profil wpływu na zdrowie jamy ustnej-14 (OHIP-14) będzie również wykorzystywany w celu uzyskania dostępu do jakości życia związanej ze zdrowiem jamy ustnej, stosowanej przed operacją i 6 miesięcy później. Wymiary oddziaływania to: ograniczenie funkcjonalne, ból fizyczny, dyskomfort psychiczny, niezdolność fizyczna, niezdolność psychiczna oraz niezdolność do wykonywania codziennych czynności. Zastosowana zostanie również adaptacja Kwestionariusza Satysfakcji Pacjenta Po Operacji (PSPSQ) do oceny satysfakcji pacjenta z zabiegu chirurgicznego w okresie pooperacyjnym wynoszącym 15 dni i 6 miesięcy. Ta 3-itemowa skala, z odpowiedzią od 0 do 10 (0 = nie przy 10 = całkowicie), jest w stanie ocenić krótko- i długoterminową satysfakcję pacjenta w okresie pooperacyjnym.

9. ocena radiograficzna

   Zdjęcia RTG okołowierzchołkowe wszystkich ubytków wewnątrzkostnych zostaną wykonane wyjściowo, po 6 miesiącach i 1 roku, techniką równoległości, przez tego samego lekarza. W celu standaryzacji zdjęć zostaną wykonane zapisy okluzyjne w chemicznie aktywowanej żywicy akrylowej z pozycjonerami radiograficznymi. Standardowy drut ortodontyczny o znanej wielkości zostanie umieszczony na wsporniku okluzyjnym w określonej pozycji, a obraz tego drutu zostanie uzyskany na radiogramach w celu korekcji kątowania pionowego i poziomego podczas analiz.

   Zdjęcia rentgenowskie będą wykonywane za pomocą systemu cyfrowego przy użyciu elastycznych i wielokrotnego użytku luminoforowych płyt do przechowywania (PSP; 31 mm x 41 mm). Wybór czasu ekspozycji nastąpi w zależności od zęba związanego z ubytkiem, ponieważ aparat, który ma być użyty (prześwietlenie rentgenowskie Sommo z ruchomą kolumną, lampa: 70 kV, 7 mA, ogniskowa: 20 cm, specyfikacja: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; posiada półautomatyczny system wyboru zębów, z ustalonymi czasami ekspozycji w zakresie od 0,32 do 0,40 sekundy. Do odczytu obrazów zostanie użyty specjalny skaner. Uzyskane obrazy będą następnie przechowywane w komputerze do momentu analizy. Domyślna rozdzielczość to 96x96 dpi i 32 bity. Wszystkie obrazy zostaną zapisane w formacie TIFF (.tif). Pomiary radiograficzne defektów zostaną wykonane za pomocą specjalnego oprogramowania do analizy obrazu. Kąty radiograficzne ubytków zostaną ocenione i określone przez dwie linie reprezentujące powierzchnię korzenia i powierzchnię ubytku kostnego.

   Zmierzone zostaną następujące liniowe parametry radiograficzne: odległość połączenia cement-szkliwo (CEJ) od podstawy ubytku (BD) (CEJ-BD); Odległość od CEJ i bardziej koronowej części grzebienia kości wyrostka zębodołowego (BC) (CEJ-BC); Odległość między BD a BC (BD-BC). Różnice między wartościami stwierdzonymi po 6 miesiącach i 1 roku po operacji a wartościami wyjściowymi dla CEJ-BD będą wskazywać na stopień wypełnienia ubytku podkostnego tkanką twardą. Różnice między CEJ-BC i BD-BC pozwolą określić odpowiednio wielkość resorpcji grzebienia kostnego i głębokość ubytku wewnątrzkostnego

10. Ocena mikrobiologiczna

    Ocena mikrobiologiczna zostanie przeprowadzona za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) typu czasu rzeczywistego. Test ten pozwoli na ilościowe wykrycie następujących bakterii: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro i P. intermedia.

    Próbki biofilmu poddziąsłowego zostaną pobrane na początku badania, 3, 6 miesięcy i 1 rok po zabiegu chirurgicznym, przez tego samego lekarza. W tym celu zostaną wykorzystane zęby i twarze wybrane wcześniej do fazy chirurgicznej. Obszar zostanie odpowiednio zaizolowany wysterylizowanymi bawełnianymi rolkami. Naddziąsłowa część biofilmu zostanie usunięta, a następnie zostaną pobrane próbki biofilmu poddziąsłowego poprzez umieszczenie sterylnych chłonnych papierowych stożków wewnątrz kieszonki. Po 30 sekundach papierowe stożki zostaną usunięte i umieszczone w probówkach do mikrowirówki z roztworem Tris-EDTA, zakodowanych dla każdego pacjenta. Do czasu wykonania badania eppendorfy należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

    W celu ekstrakcji DNA mikroprobówki zostaną worteksowane, a papierowe stożki usunięte za pomocą zacisku klinicznego. Próbki zostaną odwirowane w celu usunięcia supernatantu. Dodaje się 700 µl buforu ekstrakcyjnego, dalej wstrząsa i umieszcza w łaźni wodnej na 30 minut w temperaturze 65°C. Kolejnym krokiem będzie dodanie 650 µl CIA, homogenizacja do emulsji (20 razy) i wirowanie przy 12 000-15 000 obr./min przez 7 minut. Faza wodna zostanie przeniesiona do nowej 1,5 ml mikroprobówki, do której zostanie dodane 200 µl buforu ekstrakcyjnego bez proteinazy K. Następnie zostanie przeprowadzona homogenizacja w celu dodania 650 µl CIA. Dalszą homogenizację i wirowanie przy 12 000-15 000 obr./min kontynuuje się przez 7 minut. Faza wodna zostanie przeniesiona do nowej probówki, do której zostanie dodane 650 μl CIA, a następnie wirowane przy 12 000-15 000 obrotów na minutę przez 7 minut (w razie potrzeby powtórz jeszcze dwa razy). DNA zostanie wytrącone 1 objętością izopropanolu w temperaturze pokojowej, następnie homogenizowane (20 razy) i wirowane przy 12 000-15 000 obrotów na minutę przez 7 minut. Powierzchnię osadu przemywa się jednokrotnie 50 μl 70% etanolu przygotowanym na krótko przed użyciem, a następnie wiruje przez 2 minuty. Osad należy wysuszyć, pozostawiając otwartą rurkę na stole obok dyszy Busena. Następnie należy ponownie zawiesić w 40 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) + 10 μg/ml RNAzy i pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 30 minut. Pięć μl próbki zostanie użyte do sprawdzenia jakości i oszacowania ilości DNA w 0,8-1,0% Żel agarozowy. Znany wzorzec masy (pGEM) będzie działać razem.

    RYSUNEK PRIMERA PCR w czasie rzeczywistym: Zostaną użyte specyficzne startery dla Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia i A. actinomycetemcomitans. Wszystkie startery zostaną sprawdzone pod kątem specyficzności poprzez sprawdzenie krzywej topnienia (uzyskanej po przejściu w LightCycler) i przepuszczenie żelu w celu weryfikacji produktu.

    OPTYMALIZACJA REAKCJI: Zastosowanie SYBR Green I wymaga specyficznych produktów PCR, dzięki którym efektywność reakcji starterów zostanie zoptymalizowana przed rozpoczęciem samych reakcji. Stężenia w zakresie od 2 do 5 mM MgCl2 i od 0,2 do 0,5 μM każdego startera zostaną wykorzystane do określenia, w jakich warunkach reakcja będzie miała najlepszą wydajność. Warunki sugerowane przez producenta sprzętu.

    Reakcje RT-PCR: Reakcje RT-PCR będą przeprowadzane przy użyciu systemu LightCycler przy użyciu zestawu FastStart DNA Master SYBR Green I. Profil reakcji zostanie określony zgodnie z zaleceniami producenta sprzętu. W każdym z „przebiegów” woda będzie używana jako kontrola negatywna, a produkt reakcji będzie oznaczany ilościowo przy użyciu własnego programu producenta.

11. Test immunoenzymatyczny (platforma Luminex / MAGpix)

    Pobieranie płynu dziąsłowego (GCF) będzie wykonywane na początku badania, 15, 45 dni, 3, 6 miesięcy i 1 rok po badaniu, przez tego samego lekarza. W tym celu zostaną wykorzystane zęby i twarze wybrane wcześniej do fazy chirurgicznej. Podczas pobierania materiału miejsce to zostanie odpowiednio zaizolowane i wysuszone wysterylizowanymi wacikami. Naddziąsłowa część biofilmu bakteryjnego zostanie usunięta w celu uzyskania próbek GCF poprzez umieszczenie pasków papieru na styku ząb/tkanka przyzębia na 30 sekund. Dwa paski papieru na miejsce zostaną wykorzystane do uzyskania odpowiednich, a paski papieru zostaną następnie umieszczone w probówkach do mikrowirówki, zakodowanych dla każdego indywidualnego i eksperymentalnego okresu z 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 0,05% Tween-20. Próbki będą przechowywane do dalszej analizy.

    Przed analizą próbki płynu zostaną rozcieńczone w 60 μl buforu z zestawu Millipore, worteksowane przez 30 minut, a następnie wirowane przez 10 minut przy 10 000 obr./min. Porcje każdej próbki GCF będą analizowane pod kątem wykrywania markerów kostnych (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH i RANKL) za pomocą technologii Luminex / MAGpix. W tym celu analizy zostaną przeprowadzone na płytkach 96-dołkowych za pomocą paneli o wysokiej czułości, zgodnie z zaleceniami producenta. Pokrótce, studzienki zostaną przemyte buforem do przemywania i odessane. Ekskluzywne mikrosfery skoniugowane z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko różnym analitom, które mają być analizowane, zostaną dodane do dołków (mikrosfery polistyrenowe są barwione dokładnymi proporcjami dwóch fluoroforów, tworząc „kod koloru” do dalszej identyfikacji przez instrument Luminex / MAGpix). Próbki i odczynniki do krzywej wzorcowej zostaną odpipetowane do studzienek i inkubowane przez noc w temperaturze 4oC. Następnie studzienki zostaną przemyte i dodana zostanie mieszanina drugorzędowych przeciwciał. Po inkubacji przez 1 godzinę, ostateczna detekcja zostanie przeprowadzona przez trzeci znacznik fluorescencyjny, streptawidyna-fikoerytryna (PE) związany z przeciwciałem wykrywającym. Sprzęt Luminex / MAGpix będzie przesuwał te kulki w jednym pliku przez wiązki dwóch różnych laserów na cytometrze przepływowym. Pierwsza wiązka laserowa wykryje (sklasyfikuje) mikrosferę (kod kolorystyczny testu), a druga zmierzy ilościowo sygnał raportujący w każdej mikrosferze. Próbki będą indywidualnie analizowane, a ich stężenia zostaną oszacowane na podstawie krzywej wzorcowej przy użyciu równania wielomianowego przy użyciu oprogramowania Xponent. Średnie stężenia każdego markera zostaną wyrażone w pg/μl. Próbki o oznaczeniu ilościowym poniżej granicy wykrywalności analizy rejestruje się jako „zero”, a próbki powyżej granicy oznaczalności krzywej wzorcowej rejestruje się jako równą najwyższej wartości krzywej.

12. Analiza wyników Analiza wyników zostanie przeprowadzona za pomocą statystyk opisowych z wykorzystaniem tabel i wykresów zawierających częstości bezwzględne i względne oraz parametry średniej i odchylenia standardowego. Porównanie zmiennych ilościowych zostanie przeprowadzone za pomocą analizy wariancji i testu Tukeya. Zmienne jakościowe zostaną porównane za pomocą testu chi-kwadrat. Sprawdzenie korelacji między zmiennymi zostanie przeprowadzone za pomocą współczynnika korelacji Pearsona i Spearmana. We wszystkich testach przyjęty zostanie poziom istotności 5%.