Emaljmatrisproteiner vid behandling av intrabony defekter hos patienter med aggressiv och kronisk parodontit

Allmän arbetsplan och experimentell metodik

1. Provval

   Efter inlämning och godkännande av detta projekt till forskningsetiska kommittén (CEP) vid Piracicaba Dental School - UNICAMP, kommer att väljas ut bland de patienter som söker spontant behandling på kliniker efter examen FOP-UNICAMP (där också kommer att utföras den kliniska fasen av studien), 45 patienter enligt inklusionskriterierna

2. Provtagningskalkyl

   Den urvalsstorlek som krävs för varje grupp beräknades med hänsyn till den kliniska anknytningsnivån (CAL) som den primära variabeln. För att upptäcka en skillnad på 1 mm med 5 % alfa mellan grupperna, med tanke på en standardavvikelse på 1 mm fel och 80 % teststyrka, krävs minst 12 patienter i varje grupp. Med tanke på att vissa patienter kan gå förlorade under uppföljningen kommer 15 patienter att inkluderas i denna studie.

3. Randomisering och blindning

   Examinatorn kommer att vara blind för behandlingarna. Detta uppnås genom att fastställa att bedömningarna görs av en professionell som inte är involverad i behandlingen. Indelningen av patienter i en grupp bör göras genom lottning för att vara ett helt slumpmässigt urval, med behandlingar slumpmässigt fördelade mellan patienter. Bruna kuvert kommer att användas, vid tidpunkten för det kirurgiska ingreppet, innehållande information från behandlingsgruppen som genererats genom ett datoriserat system.

4. Studera design

   En parallell studie kommer att genomföras på 45 patienter, med en varaktighet på ett år. De utvalda patienterna kommer att delas in i 3 grupper, vars tänder kommer att få de föreslagna behandlingarna, enligt följande:

   • Group GAP Surgical Access (GAP + OFD, 15 patienter) - Patienter som diagnostiserats med generaliserad aggressiv parodontit (PAG), där den tidigare valda intrabony defekten kommer att få kommer att få öppen flikdebridering.
   • Group GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 patienter) - Patienter med diagnosen generaliserad aggressiv parodontit (PAG), där den tidigare valda intrabenade defekten kommer att få öppen flikdebridering och dessutom applicering av EMD i defekten.
   • Group GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 patienter) - Patienter med diagnosen generaliserad kronisk parodontit (PCG), där den tidigare valda intrabenedefekten kommer att få öppen flikdebridering och dessutom applicering av EMD i defekten.

5. Förkirurgisk fas

   Inledande undersökning: Urval av patienter enligt förutbestämda kriterier.

   Initial terapi: Alla patienter kommer att utbildas om orsakerna och konsekvenserna av parodontit sjukdom samt om förebyggande tekniker, inklusive teknik för sulkulär borstning och tandtråd. Individer kommer att få mjuka borstar tillsammans med en fluortandkräm, som kommer att fyllas på vid behov. Professionellt avlägsnande av biofilm och supragingival tandsten kommer att utföras, liksom biofilmretentionsfaktorer, vid behov.

   Behandling: Fjällning och rothyvling av alla tänder som ger en indikation. Efter den aktiva fasen av behandlingen kommer patienter att inkluderas i stödbehandling med kontroller varannan vecka under den första månaden och varje månad, fram till slutet av studien, innehållande hygienorientering, profylax och kvartalsvis återbehandling av tänder som har ett sonderingsdjup som är större än 5 mm, med BoP.

6. Kirurgisk fas

   Tänder som uppvisar kvarvarande sonderingsdjup ≥ 6 mm förknippade med radiografiska bevis på intraboby-effekter, enligt inklusionskriterierna ovan, kommer att inkluderas i det kirurgiska ingreppet. Regenerativa ingrepp kommer endast att schemaläggas när alla nödvändiga icke-kirurgiska ingrepp utförs samtidigt med adekvata PI- och GI-nivåer på upp till 20 %. Alla kirurgiska ingrepp kommer att utföras av samma operatör. En timme före behandlingen kommer patienterna att få en engångsdos av dexametason 4 mg.

   Beskrivning av tekniken: Efter administrering av lokalbedövningsmedel höjs flikarna i full tjocklek för att komma åt alla defekta ansikten. Sulkulära snitt kommer att utföras som sträcker sig till mesiala och distala intilliggande tänder, inklusive hela papillen i fliken. Inga avslappnande snitt kommer att utföras. All granulationsvävnad kommer sedan att avlägsnas försiktigt, och därefter kommer fjällning och rothyvling att utföras. Det kirurgiska området kommer att sköljas med 0,9 % koksaltlösning och inspekteras noggrant för att säkerställa att alla steg har utförts på ett tillfredsställande sätt fram till dess. Efter denna inledande fas av det kirurgiska ingreppet kommer defekterna att randomiseras. För grupperna GAP + OFD/EMD och GCP + OFD/EMD kommer det att finnas tillämpning av EMD i defekten. För detta bör ytan i fråga vara fri från saliv och blod. Detta ämne kommer att appliceras omedelbart på den exponerade rotytan. Appliceringen börjar vid den mest apikala delen av bennivån tills den totala täckningen av defekten och rotytan. Flikarna kommer sedan att omplaceras och sys passivt tills den primära stängningen av vävnaderna.

   Postoperativ vård: Patienterna kommer att instrueras att ta analgetikum (natriumdipyron 500 mg var 4:e timme i 2 dagar) och kelat 0,12 % klorhexidindiglukonat (2 gånger om dagen i 15 dagar). Suturerna kommer att tas bort efter 15 dagar efter det kirurgiska ingreppet. Under den postoperativa perioden kommer patienten att bli ombedd att sluta borsta och använda tandtråd i ingreppsområdet i 15 dagar, då munhygienvanorna kommer att återupptas.

7. Klinisk utvärdering

   Förkalibreringen av undersökaren för mätningarna kommer att utföras för att säkerställa tillförlitligheten hos de data som erhållits genom två undersökningar, med ett maximalt intervall på 48 timmar mellan dem, hos 8 olika patienter som inte är forskningspatienter. Kappa-index och intraklasskorrelation kommer att användas för att utvärdera reproducerbarhet och överensstämmelse.

   Alla kliniska parametrar kommer att erhållas med hjälp av en tandlossningssond av North Carolina-typ, vid baslinjen, 3, 6 månader och 1 år därefter, med hjälp av stentar/individuella akrylguider, gjorda av förformade studiemodeller av granskaren.

   De kliniska parametrarna som utvärderas kommer att vara: Plate Index - PI; Blödning vid sondering - BoP; Gingivalmarginalposition - GMP: avstånd från stenten till den fria gingivalmarginalen; Relativ klinisk fastsättningsnivå - rCAL: avstånd från stenten till den kliniskt detekterbara basen av parodontala fickan; Probing Depth - PD (rCAL - GMP): avstånd från tandköttskanten till den kliniskt detekterbara basen av parodontala fickan.

   Vid den transkirurgiska tidpunkten kommer följande mätningar att utföras: Avstånd mellan stentmarginalen och alveolarbenskaftet (BC-ST); Avståndet mellan den alveolära benkammen och basen av defekten (BC-BD), som kännetecknar den vertikala komponenten av den intrabony defekten; Avstånd från den alveolära benkammen till rotytan (BC-RS), som kännetecknar defektens horisontella komponent.

8. Patientnöjdhet och uppfattning om terapi

   För bedömning av patientens uppfattning om det utförda ingreppet och den postoperativa perioden kommer de att få ett frågeformulär 15 dagar efter ingreppet. Omfattningen av obehag och/eller smärta som upplevs under den transoperativa perioden kommer att utvärderas med en 100 mm horisontell analog visuell skala (VAS), som sträcker sig från frånvaro till extrem. Patienterna kommer också att instrueras att kvantifiera mängden analgetikum som används. Dessutom kommer omfattningen av besvär, radikulär överkänslighet, ödem, hematom, feber och störningar av dagliga aktiviteter under den första postoperativa veckan att bedömas på samma sätt. Efter 6 månader av det kirurgiska ingreppet kommer ytterligare ett frågeformulär att levereras för att fastställa individernas uppfattning om resultaten och graden av tillfredsställelse med behandlingen. Enkäten kommer att använda en förenklad skala för att registrera behandlingstillfredsställelse när det gäller den behandlade tandens estetiska utseende genom att välja något av följande: Mycket nöjd, neutral, måttligt nöjd eller missnöjd. Dessutom kommer patienter att ifrågasättas om deras uppfattningar om resultaten av terapi som tillämpas på tänderna i fråga, vad gäller förbättring av tandköttsblödningar, rodnad, ödem och hygienmönster. Dessa parametrar kommer också att utvärderas genom VAS-skalan, 0 är ingen förbättring och 100 är den maximala förbättringen. Oral Health Impact Profile-14 (OHIP-14) kommer också att användas för att få tillgång till oral hälsorelaterad livskvalitet, tillämpad före operation och 6 månader senare. Dimensionerna av påverkan är: funktionsbegränsning, fysisk smärta, psykiskt obehag, fysisk oförmåga, psykisk oförmåga och funktionsnedsättning att utföra dagliga aktiviteter. En anpassning av Post-Surgical Patient Satisfaction Questionnaire (PSPSQ) kommer också att tillämpas för att utvärdera patientens tillfredsställelse med det kirurgiska ingreppet under den postoperativa perioden på 15 dagar och 6 månader. Denna 3-punktsskala, med ett svar från 0 till 10 (0 = inte vid 10 = totalt), är kapabel att utvärdera patientens kort- och långsiktiga tillfredsställelse under den postoperativa perioden.

9. Radiografisk utvärdering[

   Periapikala röntgenbilder av alla intrabony defekter kommer att utföras vid baslinjen, efter 6 månader och 1 år, med hjälp av parallellitetsteknik, av samma undersökare. För standardisering av bilderna kommer att göras ocklusala registreringar i kemiskt aktiverat akrylharts med radiografiska positionerare. En standard ortodontisk tråd av känd storlek kommer att placeras på det ocklusala stödet vid en specifik position, och bilden av denna tråd kommer att erhållas på röntgenbilder för korrigering av vertikal och horisontell vinkling under analyserna.

   Röntgenstrålningen kommer att utföras av ett digitalt system som använder flexibla och återanvändbara fosforlagringsplattor (PSP; 31 mm x 41 mm). Valet av exponeringstid kommer att ske i enlighet med den tand som är relaterad till defekten, eftersom apparaten som ska användas (Sommo röntgen av mobil kolonn, rör: 70 kV, 7 mA, brännvidd: 20 cm, specifikationer: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; har ett halvautomatiskt tandvalssystem, med etablerade exponeringstider som sträcker sig från 0,32 till 0,40 sekunder. För att läsa bilderna kommer en specifik scanner att användas. De erhållna bilderna kommer sedan att lagras i en dator fram till analysögonblicket. Standardupplösningen kommer att vara 96x96 dpi och 32 bitar. Alla bilder kommer att spelas in i TIFF-format (.tif). Radiografiska mätningar av defekter kommer att utföras med hjälp av specifik programvara för bildanalys. De radiografiska vinklarna för defekterna kommer att utvärderas och definieras av två linjer som representerar rotytan och bendefektens yta.

   Följande linjära radiografiska parametrar kommer att mätas: cement-emalj övergångsavstånd (CEJ) till basen av defekten (BD) (CEJ-BD); Avstånd från CEJ och den mer koronala delen av den alveolära benkammen (BC) (CEJ-BC); Avstånd mellan BD och BC (BD-BC). Skillnader mellan värdena som hittats 6 månader och 1 år postoperativt och baslinjen för CEJ-BD kommer att indikera mängden hårdvävnadsfyllning av den infra-ossösa defekten. Skillnader mellan CEJ-BC och BD-BC kommer att identifiera mängden resorption av benkammen respektive djupet av den intrabony defekten

10. Mikrobiologisk utvärdering

    Den mikrobiologiska utvärderingen kommer att göras genom polymeraskedjereaktionen (PCR) av realtidstyp. Detta test kommer att möjliggöra kvantitativ detektering av följande bakterier: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro och P. intermedia.

    Subgingivala biofilmprover kommer att utföras vid baslinjen, 3, 6 månader och 1 år efter det kirurgiska ingreppet, av samma undersökare. För att göra detta kommer de tänder och ansikten som tidigare valts för den kirurgiska fasen att användas. Området kommer att vara ordentligt isolerat med steriliserade bomullsrullar. Den supragingivala delen av biofilmen kommer att tas bort, och sedan kommer prover av den subgingivala biofilmen att tas genom att placera sterila absorberande papperskoner inuti fickan. Efter 30 sekunder tas papperskonerna bort och placeras i mikrocentrifugrör med Tris-EDTA-lösning, kodade för varje patient. Eppendorferna ska hållas vid -20 °C tills provet utförs.

    För DNA-extraktion kommer mikrorören att vortexas och papperskonerna tas bort med klinisk klämhjälp. Prover kommer att centrifugeras för avlägsnande av supernatanten. 700 µL extraktionsbuffert tillsätts, skakas ytterligare och placeras i ett vattenbad i 30 minuter vid 65 ° C. Nästa steg blir att tillsätta 650 μl CIA, homogenisera till en emulsion (20 gånger) och centrifugera vid 12 000-15 000 rpm för 7 minuter. Vattenfasen kommer att överföras till ett nytt 1,5 ml mikrorör, till vilket 200 µL extraktionsbuffert utan proteinas K kommer att tillsättas. Homogenisering kommer sedan att göras för tillsats av 650 µL CIA. Ytterligare homogenisering och centrifugering vid 12 000-15 000 rpm fortsätter under 7 minuter. Vattenfasen kommer att överföras till ett nytt rör, till vilket 650 μl CIA kommer att tillsättas, följt av centrifugering vid 12 000-15 000 rpm i 7 minuter (upprepa ytterligare två gånger om det behövs). DNA:t kommer att fällas ut med 1 volym isopropanol vid rumstemperatur, homogeniseras sedan (20 gånger) och centrifugeras vid 12 000-15 000 rpm under 7 minuter. Ytan på fällningen tvättas en gång med 50 μl 70 % etanol som framställts strax före användning och centrifugeras sedan i 2 minuter. Fällningen ska torkas, lämna röret öppet på bänken bredvid Busens munstycke. Efteråt kommer återsuspension att göras i 40 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) + 10 μg / ml RNAse och lämna i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 minuter. Fem μL av provet kommer att användas för att kontrollera kvaliteten och uppskatta mängden DNA i en 0,8-1,0 % agarosgel. En känd massstandard (pGEM) kommer att köras tillsammans.

    Realtids-PCR-RITNING AV PRIMER: Specifika primers för Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia och A. actinomycetemcomitans kommer att användas. Alla primers kommer att kontrolleras för specificitet genom att kontrollera smältkurvan (erhållen efter körning i LightCycler) och körgel för produktverifiering.

    OPTIMERING AV REAKTIONER: Användningen av SYBR Green I kräver specifika PCR-produkter, så att effektiviteten av primerreaktionerna kommer att optimeras innan själva reaktionerna initieras. Koncentrationer från 2 till 5 mM MgCl2 och från 0,2 till 0,5 μM av varje primer kommer att användas för att bestämma under vilka förhållanden reaktionen skulle ha den bästa effektiviteten. Villkor som föreslagits av utrustningstillverkaren.

    RT-PCR-reaktioner: RT-PCR-reaktioner kommer att utföras med LightCycler-systemet med hjälp av FastStart DNA Master SYBR Green I kit. Reaktionsprofilen kommer att bestämmas enligt utrustningstillverkarens rekommendationer. För var och en av "körningarna" kommer vattnet att användas som en negativ kontroll, och reaktionsprodukten kommer att kvantifieras med hjälp av tillverkarens eget program.

11. Immunoenzymatiskt test (Luminex plattform / MAGpix)

    Samlingar av Gingival Crevicular Fluid (GCF) kommer att utföras vid baslinjen, 15, 45 dagar, 3, 6 månader och 1 år efter studien, av samma granskare. För att göra detta kommer de tänder och ansikten som tidigare valts för den kirurgiska fasen att användas. Under insamlingen av materialet kommer den berörda platsen att isoleras ordentligt och torkas med steriliserade bomullsrullar. Den supragingivala delen av den bakteriella biofilmen kommer att tas bort för att erhålla GCF-prover genom att placera pappersremsor i gränssnittet mellan tand och parodontal vävnad i 30 sekunder. Två pappersremsor per plats kommer att användas för att erhålla lämpliga och pappersremsorna kommer sedan att placeras i mikrocentrifugrör, kodade för varje individuell och experimentperiod med 150 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 0,05 % Tween-20. Proverna kommer att lagras för vidare analys.

    Före analys kommer vätskeproverna att spädas ut i 60 μl buffert från Millipore-kitet, vortexas i 30 minuter och centrifugeras sedan i 10 minuter vid 10 000 rpm. Alikvoter av varje GCF-prov kommer att analyseras för detektering av benmarkörer (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH och RANKL) med Luminex / MAGpix-teknologi. För att göra detta kommer analyserna att utföras i plattor med 96 brunnar med hjälp av högkänsliga paneler, enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat kommer brunnarna att tvättas med tvättbuffert och aspireras. Exklusiva mikrosfärer konjugerade till monoklonala antikroppar mot de olika analyterna som ska analyseras kommer att läggas till brunnarna (polystyrenmikrosfärerna färgas med exakta proportioner av två fluoroforer, vilket skapar en "färgkod" för ytterligare identifiering av Luminex / MAGpix-instrumentet). Prover och reagenser för standardkurvan pipetteras in i brunnarna och inkuberas över natten vid 4oC. Brunnarna kommer sedan att tvättas och en blandning av sekundära antikroppar tillsätts. Efter inkubation i 1 timme kommer den slutliga detektionen att göras genom en tredje fluorescerande märkning, Streptavidin-Phycoerythrin (PE) bundet till detektionsantikroppen. Luminex / MAGpix-utrustningen kommer att flytta dessa pärlor i en fil genom buntar av två olika lasrar på en flödescytometer. Den första laserstrålen kommer att detektera (klassificera) mikrosfären (färgkoden för testet) och den andra lasern kommer att kvantifiera rapporteringssignalen i varje mikrosfär. Proverna kommer att analyseras individuellt och deras koncentrationer kommer att uppskattas från en standardkurva med hjälp av en polynomekvation med Xponent-programvara. Medelkoncentrationerna av varje markör kommer att uttryckas i pg / μl. Prover med kvantifiering under analysens detektionsgräns ska registreras som "noll" och prover över gränsen för kvantifiering av standardkurvan ska registreras lika med kurvans högsta värde.

12. Analys av resultat Analysen av resultaten kommer att göras genom beskrivande statistik med hjälp av tabeller och grafer som innehåller absoluta och relativa frekvenser och parametrar för medelvärde och standardavvikelse. Jämförelsen av de kvantitativa variablerna kommer att göras genom variansanalys och Tukeys test. Kvalitativa variabler kommer att jämföras med hjälp av chi-kvadrattestet. Korrelationskontrollen mellan variablerna kommer att göras genom Pearson och Spearmans korrelationskoefficient. I alla tester kommer en signifikansnivå på 5 % att antas.