Proteiny sklovinné matrice v léčbě intrabonálních defektů u pacientů s agresivní a chronickou parodontitidou

Obecný pracovní plán a experimentální metodika

1. Výběr vzorku

   Po předložení a schválení tohoto projektu Etické komisi pro výzkum (CEP) zubní školy Piracicaba - UNICAMP, bude vybrán mezi pacienty, kteří spontánně vyhledávají léčbu na klinikách po absolvent FOP-UNICAMP (kde také proběhne klinická fáze studie), 45 pacientů podle kritérií pro zařazení

2. Vzorkovací počet

   Velikost vzorku požadovaná pro každou skupinu byla vypočtena s ohledem na úroveň klinického připojení (CAL) jako primární proměnnou. K detekci rozdílu 1 mm s 5 % alfa mezi skupinami, s uvážením standardní odchylky 1 mm chyby a 80 % síly testu, bude zapotřebí alespoň 12 pacientů v každé skupině. Vzhledem k tomu, že někteří pacienti mohou být ztraceni během sledování, bude do této studie zahrnuto 15 pacientů.

3. Randomizace a zaslepení

   Zkoušející bude slepý k léčbě. Toho je dosaženo určením, že hodnocení provádí odborník, který se na léčbě nepodílí. Rozdělení pacientů do skupiny by mělo být provedeno losem, aby se jednalo o zcela náhodný vzorek, s léčbou náhodně rozdělenou mezi pacienty. V době chirurgického zákroku budou použity hnědé obálky obsahující informace od léčené skupiny, které byly vytvořeny prostřednictvím počítačového systému.

4. Studovat design

   Bude provedena paralelní studie na 45 pacientech po dobu jednoho roku. Vybraní pacienti budou rozděleni do 3 skupin, jejichž zuby dostanou navržená ošetření, a to následovně:

   • Skupinový chirurgický přístup GAP (GAP + OFD, 15 pacientů) - Pacienti s diagnostikovanou generalizovanou agresivní parodontitidou (PAG), u kterých dostane dříve vybraný nitrokostní defekt, dostanou debridement otevřeným lalokem.
   • Skupina GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 pacientů) - Pacienti s diagnózou generalizované agresivní parodontitidy (PAG), u kterých bude u dříve zvoleného intrabonitního defektu proveden debridement otevřeným lalokem a navíc aplikace EMD. v defektu.
   • Skupina GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 pacientů) - Pacienti s diagnózou generalizované chronické parodontitidy (PCG), u kterých bude u dříve zvoleného intrabonitního defektu proveden debridement otevřeným lalokem a navíc aplikace EMD. v defektu.

5. Předoperační fáze

   Vstupní vyšetření: Výběr pacientů podle předem stanovených kritérií.

   Vstupní terapie: Všichni pacienti budou poučeni o příčinách a důsledcích onemocnění parodontu a také o preventivních technikách, včetně techniky čištění zubů a používání zubní nitě. Jednotlivci dostanou měkké kartáčky ve spojení s fluoridovou zubní pastou, která bude dle potřeby doplňována. Bude provedeno odborné odstranění biofilmu a supragingiválního kamene, v případě potřeby i retenčních faktorů biofilmu.

   Léčba: Odlupování a hoblování kořenů všech zubů, které představují indikaci. Po aktivní fázi léčby budou pacienti zařazeni do podpůrné terapie s dvoutýdenními kontrolami v prvním měsíci a měsíčně až do konce studie, obsahující hygienickou orientaci, profylaxi a čtvrtletní doléčování zubů, které mají hloubku sondování větší než 5 mm, s BoP.

6. Operační fáze

   Zuby, které vykazují zbytkovou hloubku sondování ≥ 6 mm spojené s radiografickým průkazem defektů uvnitř bobu, podle kritérií pro zařazení zmíněných výše, budou zahrnuty do chirurgického zákroku. Regenerační postupy budou naplánovány pouze tehdy, když budou provedeny všechny nezbytné nechirurgické výkony současně s adekvátními hladinami PI a GI až do 20 %. Všechny chirurgické zákroky bude provádět stejný operátor. Jednu hodinu před léčbou dostanou pacienti jednu dávku dexamethasonu 4 mg.

   Popis techniky: Po podání lokálních anestetik se zvednou chlopně v plné tloušťce, aby byl přístup ke všem plochám defektu. Sulkulární řezy budou provedeny zasahující do meziálních a distálních sousedních zubů, včetně celé papily v laloku. Nebudou prováděny žádné relaxační řezy. Následně bude pečlivě odstraněna veškerá granulační tkáň a následně bude provedeno okujení a ohoblování kořenů. Chirurgická oblast bude opláchnuta 0,9% fyziologickým roztokem a pečlivě zkontrolována, aby bylo zajištěno, že do té doby byly všechny kroky uspokojivě provedeny. Po této počáteční fázi operačního výkonu budou defekty randomizovány. Pro skupiny GAP + OFD/EMD a GCP + OFD/EMD bude aplikace EMD v defektu. Za tímto účelem by měl být povrch bez slin a krve. Tato látka bude okamžitě aplikována na exponovaný povrch kořene. Aplikace začne v nejapikálnější části úrovně kosti až do úplného pokrytí defektu a povrchu kořene. Klapky budou poté přemístěny a pasivně sešity až do primárního uzavření tkání.

   Pooperační péče: Pacienti budou poučeni, aby užívali analgetikum (dipyron sodný 500 mg každé 4 hodiny po dobu 2 dnů) a chelát 0,12% chlorhexidin diglukonát (2krát denně po dobu 15 dnů). Stehy budou odstraněny po 15 dnech po chirurgickém zákroku. V pooperačním období bude pacient požádán, aby na 15 dní, kdy se obnoví návyky ústní hygieny, přestal v oblasti zákroku čistit kartáčkem a nití.

7. Klinické hodnocení

   Předkalibrace vyšetřujícího pro měření bude provedena pro zajištění spolehlivosti dat získaných prostřednictvím dvou vyšetření, s maximálním odstupem 48 hodin mezi nimi, u 8 různých nevýzkumných pacientů. K hodnocení reprodukovatelnosti a shody bude použit index kappa a korelace uvnitř třídy.

   Všechny klinické parametry budou získány pomocí periodontální sondy typu Severní Karolína na začátku, 3, 6 měsíců a 1 rok poté, s pomocí stentů/individuálních akrylových vodítek, vyrobených z předem vytvořených studijních modelů vyšetřujícím.

   Hodnocené klinické parametry budou: Plate Index - PI; Krvácení při sondování – BoP; Poloha gingiválního okraje - GMP: vzdálenost od stentu k volnému gingiválnímu okraji; Relative Clinical Attachement Leval - rCAL: vzdálenost od stentu ke klinicky detekovatelné bázi periodontální kapsy; Hloubka sondy - PD (rCAL - GMP): vzdálenost od gingiválního okraje ke klinicky detekovatelné spodině parodontální kapsy.

   V transchirurgickém čase budou provedena následující měření: Vzdálenost mezi okrajem stentu a hřebenem alveolární kosti (BC-ST); Vzdálenost mezi hřebenem alveolární kosti a spodinou defektu (BC-BD), charakterizující vertikální složku intrabonálního defektu; Vzdálenost hřebene alveolární kosti k povrchu kořene (BC-RS), charakterizující horizontální složku defektu.

8. Spokojenost pacientů a vnímání terapie

   Pro posouzení pacientova vnímání provedeného výkonu a pooperačního období obdrží 15 dní po výkonu dotazník. Rozsah nepohodlí a/nebo bolesti pociťovaný během transoperačního období bude hodnocen pomocí 100mm horizontální analogové vizuální stupnice (VAS), v rozsahu od nepřítomnosti po extrém. Pacienti budou také poučeni, aby kvantifikovali množství použitého analgetika. Kromě toho bude stejným způsobem hodnocen rozsah diskomfortu, radikulární hypersenzitivita, edém, hematom, horečka a interference s denními aktivitami během prvního pooperačního týdne. Po 6 měsících od chirurgického zákroku bude doručen další dotazník, který určí, jak jednotlivci vnímají výsledky a míru spokojenosti s léčbou. Dotazník bude pomocí zjednodušené škály zaznamenávat spokojenost s ošetřením z hlediska estetického vzhledu ošetřovaného zubu výběrem jedné z následujících možností: Velmi spokojený, neutrální, středně spokojený nebo nespokojený. Kromě toho budou pacienti dotázáni na jejich vnímání výsledků terapie aplikované na příslušné zuby, pokud jde o zlepšení krvácení dásní, zarudnutí, otoky a hygienický vzor. Tyto parametry budou také hodnoceny pomocí stupnice VAS, kde 0 znamená žádné zlepšení a 100 znamená maximální zlepšení. Profil dopadu na orální zdraví-14 (OHIP-14) bude také použit za účelem získání přístupu ke kvalitě života související s orálním zdravím, aplikovaný před operací a o 6 měsíců později. Dimenze dopadu jsou: funkční omezení, fyzická bolest, psychická nepohoda, fyzická neschopnost, psychická neschopnost a neschopnost vykonávat každodenní činnosti. Pro hodnocení spokojenosti pacienta s operačním výkonem v pooperačním období 15 dnů a 6 měsíců bude aplikována také úprava Post-Surgical Patient Satisfaction Questionnaire (PSPSQ). Tato 3-položková škála s odpovědí od 0 do 10 (0 = ne na 10 = zcela) je schopna vyhodnotit krátkodobou i dlouhodobou spokojenost pacienta v pooperačním období.

9. Rentgenové hodnocení[

   Periapické rentgenové snímky všech nitrokostních defektů budou provedeny na začátku, po 6 měsících a 1 roce, s použitím techniky paralelismu, stejným vyšetřovatelem. Pro standardizaci snímků budou provedeny okluzní záznamy v chemicky aktivované akrylové pryskyřici s radiografickými polohovadly. Standardní ortodontický drát o známé velikosti bude umístěn na okluzní podporu v konkrétní poloze a obraz tohoto drátu bude získán na rentgenových snímcích pro korekci vertikální a horizontální angulace během analýz.

   Rentgenové snímky budou prováděny digitálním systémem pomocí flexibilních a opakovaně použitelných fosforových paměťových desek (PSP; 31 mm x 41 mm). Volba expozičního času bude probíhat podle zubu souvisejícího s defektem, protože použitý přístroj (Sommo rentgen mobilního sloupu, trubice: 70 kV, 7 mA, ohnisková vzdálenost: 20 cm, specifikace: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; má poloautomatický systém výběru zubů se stanovenými expozičními časy v rozmezí od 0,32 do 0,40 sekund. Pro čtení obrázků bude použit specifický skener. Získané snímky budou poté uloženy v počítači až do okamžiku analýzy. Výchozí rozlišení bude 96 x 96 dpi a 32 bitů. Všechny snímky budou zaznamenány ve formátu TIFF (.tif). Radiografická měření defektů budou provedena pomocí specifického softwaru pro analýzu obrazu. Radiografické úhly defektů budou vyhodnoceny a definovány dvěma čarami představujícími povrch kořene a povrch kostního defektu.

   Budou měřeny následující lineární radiografické parametry: vzdálenost spojení cement-smalt (CEJ) k bázi defektu (BD) (CEJ-BD); Vzdálenost od CEJ a koronálnější části hřebene alveolární kosti (BC) (CEJ-BC); Vzdálenost mezi BD a BC (BD-BC). Rozdíly mezi hodnotami zjištěnými za 6 měsíců a 1 rok po operaci a výchozí hodnotou pro CEJ-BD budou ukazovat na množství tvrdé tkáňové výplně infrakostního defektu. Rozdíly mezi CEJ-BC a BD-BC určí míru resorpce hřebene kosti a hloubku intraboniálního defektu, resp.

10. Mikrobiologické hodnocení

    Mikrobiologické hodnocení bude provedeno pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) typu v reálném čase. Tento test umožní kvantitativní detekci následujících bakterií: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro a P. intermedia.

    Vzorky subgingiválního biofilmu budou provedeny na začátku, 3, 6 měsíců a 1 rok po chirurgickém zákroku, stejným vyšetřovatelem. K tomu se použijí zuby a obličeje, které byly předtím vybrány pro chirurgickou fázi. Oblast bude řádně izolována sterilizovanými bavlněnými rolemi. Supragingivální část biofilmu bude odstraněna a vzorky subgingiválního biofilmu budou získány umístěním sterilních absorpčních papírových kuželů do kapsy. Po 30 sekundách budou papírové kužely odstraněny a umístěny do mikrocentrifugačních zkumavek s roztokem Tris-EDTA, kódovaných pro každého pacienta. Eppendorfovy nádoby se do provedení testu udržují při teplotě -20 °C.

    Pro extrakci DNA budou mikrozkumavky vortexovány a papírové kužely odstraněny pomocí klinické svorky. Pro odstranění supernatantu budou vzorky odstředěny. Přidá se 700 µl extrakčního pufru, dále se protřepe a umístí na 30 minut do vodní lázně při 65 °C. Dalším krokem bude přidání 650 µl CIA, homogenizace na emulzi (20krát) a centrifugace při 12 000-15 000 ot./min. 7 minut. Vodná fáze bude přenesena do nové 1,5 ml mikrozkumavky, do které bude přidáno 200 µl extrakčního pufru bez proteinázy K. Poté bude provedena homogenizace pro přidání 650 ul CIA. Další homogenizace a centrifugace při 12 000-15 000 ot./min. pokračuje po dobu 7 minut. Vodná fáze se přenese do nové zkumavky, do které se přidá 650 μl CIA, následuje centrifugace při 12 000-15 000 ot./min po dobu 7 minut (v případě potřeby zopakujte ještě dvakrát). DNA se vysráží 1 objemem isopropanolu při teplotě místnosti, poté se homogenizuje (20krát) a centrifuguje při 12 000-15 000 ot./min. po dobu 7 minut. Povrch sraženiny se jednou promyje 50 μl 70% ethanolu připraveného krátce před použitím a poté se 2 minuty odstřeďuje. Sraženina by se měla vysušit a nechat zkumavku otevřenou na stole vedle Busenovy trysky. Poté se provede resuspenze ve 40 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) + 10 μg / ml RNázy a ponechá se ve vodní lázni při 37 ° C po dobu 30 minut. Pět μl vzorku bude použito ke kontrole kvality a odhadu množství DNA v 0,8-1,0 % agarózový gel. Známý hmotnostní standard (pGEM) bude fungovat společně.

    VÝKRES PRIMERŮ PCR v reálném čase: Budou použity specifické primery pro Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia a A. actinomycetemcomitans. Všechny primery budou zkontrolovány na specifičnost kontrolou křivky tání (získané po běhu v LightCycler) a běhu gelu pro ověření produktu.

    OPTIMALIZACE REAKCÍ: Použití SYBR Green I vyžaduje specifické produkty PCR, takže účinnost reakcí primerů bude optimalizována před zahájením samotných reakcí. Koncentrace v rozmezí od 2 do 5 mM MgCl2 a od 0,2 do 0,5 μM každého primeru budou použity k určení, za jakých podmínek by reakce měla nejlepší účinnost. Podmínky doporučené výrobcem zařízení.

    Reakce RT-PCR: Reakce RT-PCR budou provedeny se systémem LightCycler pomocí soupravy FastStart DNA Master SYBR Green I. Reakční profil bude určen podle doporučení výrobce zařízení. Pro každý z "běhů" bude voda použita jako negativní kontrola a reakční produkt bude kvantifikován pomocí vlastního programu výrobce.

11. Imunoenzymatický test (platforma Luminex / MAGpix)

    Odběry gingivální krevikulární tekutiny (GCF) budou provedeny na začátku studie, 15, 45 dní, 3, 6 měsíců a 1 rok po studii stejným vyšetřovatelem. K tomu se použijí zuby a obličeje, které byly předtím vybrány pro chirurgickou fázi. Během sběru materiálu bude dotčené místo řádně izolováno a vysušeno sterilizovanými bavlněnými rolemi. Supragingivální část bakteriálního biofilmu bude odstraněna, aby se získaly vzorky GCF umístěním papírových proužků do rozhraní zub / periodontální tkáň na 30 sekund. Pro získání vhodného místa budou použity dva proužky papíru na místo a papírové proužky se poté vloží do mikrocentrifugačních zkumavek, kódovaných pro každé jednotlivé a experimentální období 150 μl fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a 0,05% Tween-20. Vzorky budou uloženy pro další analýzu.

    Před analýzou budou vzorky tekutiny naředěny v 60 μl pufru ze soupravy Millipore, vortexovány po dobu 30 minut a poté centrifugovány po dobu 10 minut při 10 000 ot./min. Alikvoty každého vzorku GCF budou analyzovány pro detekci kostních markerů (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH a RANKL) technologií Luminex / MAGpix. Za tímto účelem budou analýzy prováděny na 96jamkových destičkách pomocí panelů s vysokou citlivostí podle pokynů výrobce. Krátce, jamky se promyjí promývacím pufrem a odsají. Do jamek budou přidány exkluzivní mikrokuličky konjugované s monoklonálními protilátkami proti různým analytům, které mají být analyzovány (polystyrénové mikrokuličky jsou obarveny přesnými poměry dvou fluoroforů, čímž se vytvoří "barevný kód" pro další identifikaci přístrojem Luminex / MAGpix). Vzorky a reagencie pro standardní křivku budou pipetovány do jamek a inkubovány přes noc při 4oC. Jamky se poté promyjí a přidá se směs sekundárních protilátek. Po inkubaci po dobu 1 hodiny bude konečná detekce provedena prostřednictvím třetí fluorescenční značky, Streptavidin-phycoerythrin (PE) navázané na detekční protilátku. Zařízení Luminex / MAGpix bude tyto kuličky pohybovat v jediném souboru prostřednictvím svazků dvou různých laserů na průtokovém cytometru. První laserový paprsek bude detekovat (klasifikovat) mikrosféru (barevný kód pro test) a druhý laser bude kvantifikovat oznamovací signál v každé mikrokuličce. Vzorky budou individuálně analyzovány a jejich koncentrace budou odhadnuty ze standardní křivky pomocí polynomiální rovnice pomocí softwaru Xponent. Průměrné koncentrace každého markeru budou vyjádřeny v pg/μl. Vzorky s kvantifikací pod mez detekce analýzy se zaznamenají jako "nulové" a vzorky nad mez stanovitelnosti standardní křivky se zaznamenají rovnající se nejvyšší hodnotě křivky.

12. Analýza výsledků Analýza výsledků bude provedena pomocí deskriptivní statistiky pomocí tabulek a grafů obsahujících absolutní a relativní četnosti a parametry střední a standardní odchylky. Porovnání kvantitativních proměnných bude provedeno pomocí analýzy rozptylu a Tukeyho testu. Kvalitativní proměnné budou porovnány pomocí chí-kvadrát testu. Kontrola korelace mezi proměnnými bude provedena pomocí Pearsonova a Spearmanova korelačního koeficientu. Ve všech testech bude přijata hladina významnosti 5 %.