Белки эмалевого матрикса в лечении внутрикостных дефектов у больных с агрессивным и хроническим пародонтитом

Общий план работы и экспериментальная методика

1. Выбор образца

   После представления и одобрения этого проекта Комитетом по этике исследований (CEP) Стоматологической школы Пирасикабы - UNICAMP, будут отобраны пациенты, которые спонтанно обращаются за лечением в клиниках после окончания FOP-UNICAMP (где также будет проводиться клиническая фаза исследования). исследование), 45 пациентов по критериям включения

2. Выборочное исчисление

   Размер выборки, необходимый для каждой группы, был рассчитан с учетом уровня клинической привязанности (CAL) в качестве основной переменной. Для выявления разницы в 1 мм с альфа-каналом 5% между группами, принимая во внимание стандартное отклонение ошибки в 1 мм и мощность теста 80%, потребуется не менее 12 пациентов в каждой группе. Учитывая, что некоторые пациенты могут быть потеряны во время последующего наблюдения, в настоящее исследование будут включены 15 пациентов.

3. Рандомизация и ослепление

   Экзаменатор будет слеп к лечению. Это достигается определением того, что оценки сделаны профессионалом, не участвующим в лечении. Разделение пациентов на группы должно производиться по жребию, чтобы это была полностью случайная выборка, при этом лечение распределялось между пациентами случайным образом. Во время хирургической процедуры будут использоваться коричневые конверты, содержащие информацию от лечебной группы, полученную с помощью компьютеризированной системы.

4. Дизайн исследования

   Параллельное исследование будет проведено на 45 пациентах продолжительностью один год. Отобранные пациенты будут разделены на 3 группы, зубы которых получат предлагаемое лечение следующим образом:

   • Хирургический доступ группы GAP (GAP + OFD, 15 пациентов) - Пациентам с диагнозом генерализованный агрессивный пародонтит (PAG), при котором ранее выбранный внутрикостной дефект будет обработан открытым лоскутом.
   • Группа GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 пациентов) - Пациенты с диагнозом генерализованный агрессивный пародонтит (PAG), у которых ранее выделенный внутрикостной дефект будет подвергаться санации открытым лоскутом и дополнительно наложению EMD в дефекте.
   • Группа GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 пациентов) - Пациенты с диагнозом генерализованный хронический пародонтит (ГХП), у которых ранее выделенный внутрикостной дефект будет подвергаться санации открытым лоскутом и дополнительно наложению EMD в дефекте.

5. Предоперационный этап

   Первичное обследование: Отбор пациентов по заранее установленным критериям.

   Начальная терапия: все пациенты будут проинформированы о причинах и последствиях заболеваний пародонта, а также о профилактических методах, включая технику чистки борозды и зубной нити. Людям будут выданы мягкие щетки в сочетании с зубной пастой с фтором, которая будет пополняться по мере необходимости. Будет выполнено профессиональное удаление биопленки и наддесневого камня, а также, при необходимости, ретенционные факторы биопленки.

   Лечение: удаление зубного камня и полировка корней всех зубов, на которые имеются показания. После активной фазы лечения пациенты будут включены в поддерживающую терапию с двухнедельным контролем в первый месяц и ежемесячно до конца исследования, включающую гигиеническую направленность, профилактику и ежеквартальное перелечивание зубов, глубина зондирования которых превышает 5 мм, с BoP.

6. Хирургическая фаза

   Зубы с остаточной глубиной зондирования ≥ 6 мм, связанные с рентгенологическими признаками внутриротовых дефектов, в соответствии с критериями включения, упомянутыми выше, будут включены в хирургическую процедуру. Регенеративные процедуры будут назначены только тогда, когда все необходимые нехирургические процедуры будут выполнены в сочетании с адекватными уровнями PI и GI до 20%. Все хирургические процедуры будут выполняться одним и тем же оператором. За час до терапии пациенты получают однократную дозу дексаметазона 4 мг.

   Описание метода: после введения местных анестетиков полнослойные лоскуты будут подняты, чтобы получить доступ ко всем поверхностям дефекта. Разрезы по бороздам будут выполняться до мезиальных и дистальных соседних зубов, включая весь сосочек в лоскуте. Расслабляющие разрезы выполняться не будут. Затем вся грануляционная ткань будет тщательно удалена, после чего будет проведено удаление зубного камня и полировка корней. Операционная область будет орошаться 0,9% физиологическим раствором и тщательно осмотрена, чтобы убедиться, что все этапы до этого момента были выполнены удовлетворительно. После этой начальной фазы хирургической процедуры дефекты будут рандомизированы. Для групп GAP + OFD/EMD и GCP + OFD/EMD в дефекте будет применяться EMD. Для этого рассматриваемая поверхность должна быть очищена от слюны и крови. Это вещество наносится немедленно на открытую поверхность корня. Применение начнется с самой апикальной части уровня кости до полного покрытия дефекта и поверхности корня. Затем лоскуты будут перемещены и пассивно сшиты до первичного закрытия тканей.

   Послеоперационный уход: Пациенты будут проинструктированы принимать анальгетик (дипирон натрия 500 мг каждые 4 часа в течение 2 дней) и хелатообразующий 0,12% хлоргексидин диглюконат (2 раза в день в течение 15 дней). Швы будут сняты через 15 дней после операции. В послеоперационный период пациенту будет предложено прекратить чистку зубов щеткой и зубной нитью в зоне процедуры на 15 дней, после чего возобновятся привычки к гигиене полости рта.

7. Клиническая оценка

   Предварительная калибровка экзаменатора для измерений будет выполнена для обеспечения надежности данных, полученных в результате двух обследований с максимальным интервалом в 48 часов между ними у 8 разных пациентов, не участвующих в исследовании. Каппа-индекс и внутриклассовая корреляция будут использоваться для оценки воспроизводимости и согласованности.

   Все клинические параметры будут получены с использованием пародонтального зонда типа Северной Каролины на исходном уровне, через 3, 6 месяцев и 1 год после этого с помощью стентов/индивидуальных акриловых направляющих, изготовленных исследователем из предварительно сформированных учебных моделей.

   Оцениваемыми клиническими параметрами будут: пластинчатый индекс - PI; Кровотечение при зондировании - БоП; Положение края десны - GMP: расстояние от стента до свободного края десны; Относительный уровень клинического прикрепления - rCAL: расстояние от стента до клинически определяемого основания пародонтального кармана; Глубина зондирования — PD (rCAL — GMP): расстояние от десневого края до клинически определяемого основания пародонтального кармана.

   Во время операции будут выполнены следующие измерения: расстояние между краем стента и гребнем альвеолярной кости (BC-ST); Расстояние между гребнем альвеолярного отростка и основанием дефекта (BC-BD), характеризующее вертикальный компонент внутрикостного дефекта; Расстояние от альвеолярного гребня до поверхности корня (BC-RS), характеризующее горизонтальный компонент дефекта.

8. Удовлетворенность пациентов и восприятие терапии

   Для оценки восприятия пациентом проведенной процедуры и послеоперационного периода им будет выдана анкета через 15 дней после процедуры. Степень дискомфорта и/или боли, испытываемой во время трансоперационного периода, будет оцениваться с использованием 100-миллиметровой горизонтальной аналоговой визуальной шкалы (ВАШ) в диапазоне от отсутствия до крайней степени. Пациенты также будут проинструктированы о количественном определении количества используемого анальгетика. Кроме того, таким же образом будет оцениваться степень дискомфорта, корешковая гиперчувствительность, отек, гематома, лихорадка и нарушение повседневной деятельности в течение первой послеоперационной недели. Через 6 месяцев после хирургической процедуры будет доставлен еще один вопросник, чтобы определить восприятие людьми результатов и уровень удовлетворенности лечением. Анкета будет использовать упрощенную шкалу для регистрации удовлетворенности лечением с точки зрения эстетического вида пролеченного зуба, выбирая один из следующих вариантов: очень доволен, нейтрально, умеренно удовлетворен или неудовлетворен. Кроме того, пациенты будут опрошены об их восприятии результатов терапии, примененной к рассматриваемым зубам, с точки зрения уменьшения кровоточивости десен, покраснения, отека и состояния гигиены. Эти параметры также будут оцениваться по шкале ВАШ, где 0 означает отсутствие улучшения, а 100 — максимальное улучшение. Профиль воздействия на здоровье полости рта-14 (OHIP-14) также будет использоваться для получения доступа к качеству жизни, связанному со здоровьем полости рта, применяемому до операции и через 6 месяцев. Масштабами воздействия являются: функциональное ограничение, физическая боль, психологический дискомфорт, физическая неспособность, психологическая неспособность и неспособность выполнять повседневные действия. Адаптированный вопросник послеоперационной удовлетворенности пациентов (PSPSQ) также будет применяться для оценки удовлетворенности пациента хирургической процедурой в послеоперационный период 15 дней и 6 месяцев. Эта шкала из 3 пунктов с ответом от 0 до 10 (0 = нет, 10 = полностью) способна оценить краткосрочную и долгосрочную удовлетворенность пациента в послеоперационном периоде.

9. Рентгенологическая оценка[

   Периапикальные рентгенограммы всех внутрикостных дефектов будут выполняться исходно, через 6 месяцев и 1 год с использованием техники параллелизма тем же исследователем. Для стандартизации изображений будут сделаны окклюзионные записи из химически активированной акриловой пластмассы с помощью рентгенографических позиционеров. Стандартная ортодонтическая проволока известного размера будет размещена на окклюзионной опоре в определенном положении, и изображение этой проволоки будет получено на рентгенограммах для коррекции вертикального и горизонтального угла во время анализов.

   Рентгеновские снимки будут выполняться цифровой системой с использованием гибких многоразовых пластин для хранения люминофора (PSP; 31 мм x 41 мм). Выбор времени экспозиции будет происходить в зависимости от зуба, связанного с дефектом, поскольку используемый аппарат (рентгеновский снимок подвижной колонки Sommo, трубка: 70 кВ, 7 мА, фокусное расстояние: 20 см, технические характеристики: 800- 1200 ВА, 50-60 Гц, имеет полуавтоматическую систему выбора зубьев, с установленным временем экспозиции от 0,32 до 0,40 секунды. Для чтения изображений будет использоваться специальный сканер. Полученные изображения затем будут храниться в компьютере до момента анализа. Разрешение по умолчанию будет 96x96 dpi и 32 бита. Все изображения будут записаны в формате TIFF (.tif). Рентгенографические измерения дефектов будут выполняться с использованием специального программного обеспечения для анализа изображений. Рентгенографические углы дефектов будут оцениваться и определяться двумя линиями, представляющими поверхность корня и поверхность костного дефекта.

   Будут измеряться следующие линейные рентгенографические параметры: расстояние от цементно-эмалевой границы (ЦЭГ) до основания дефекта (BD) (CEJ-BD); Расстояние от CEJ и более корональной части гребня альвеолярной кости (BC) (CEJ-BC); Расстояние между BD и BC (BD-BC). Различия между значениями, полученными через 6 месяцев и 1 год после операции, и исходным уровнем для CEJ-BD будут указывать на объем заполнения твердой тканью подкостного дефекта. Различия между CEJ-BC и BD-BC определяют степень резорбции костного гребня и глубину внутрикостного дефекта соответственно.

10. Микробиологическая оценка

    Микробиологическая оценка будет проводиться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Этот тест позволит количественно определить следующие бактерии: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro и P. intermedia.

    Образцы поддесневой биопленки будут взяты на исходном уровне, через 3, 6 месяцев и 1 год после хирургической процедуры одним и тем же исследователем. Для этого будут использоваться зубы и грани, ранее выбранные для хирургического этапа. Область будет должным образом изолирована стерилизованными ватными валиками. Наддесневая часть биопленки будет удалена, а затем будут получены образцы поддесневой биопленки путем помещения стерильных впитывающих бумажных конусов внутрь кармана. Через 30 секунд бумажные конусы будут удалены и помещены в микроцентрифужные пробирки с раствором Трис-ЭДТА, кодированные для каждого пациента. Эппендорфы должны храниться при температуре -20°C до проведения испытания.

    Для выделения ДНК микропробирки встряхивают, а бумажные конусы удаляют с помощью клинического зажима. Образцы будут центрифугированы для удаления супернатанта. Добавляют 700 мкл буфера для экстракции, дополнительно встряхивают и помещают на водяную баню на 30 минут при 65°С. Следующим шагом будет добавление 650 мкл ЦИА, гомогенизация до эмульсии (20 раз) и центрифугирование при 12000-15000 об/мин в течение 7 минут. Водную фазу переносят в новую микропробирку объемом 1,5 мл, в которую добавляют 200 мкл экстракционного буфера без протеиназы К. Затем будет проведена гомогенизация для добавления 650 мкл CIA. Дальнейшую гомогенизацию и центрифугирование при 12000-15000 об/мин продолжают в течение 7 минут. Водную фазу переносят в новую пробирку, в которую добавляют 650 мкл CIA с последующим центрифугированием при 12 000–15 000 об/мин в течение 7 минут (при необходимости повторить еще два раза). ДНК осаждают 1 объемом изопропанола при комнатной температуре, затем гомогенизируют (20 раз) и центрифугируют при 12000-15000 об/мин в течение 7 минут. Поверхность осадка промывают один раз 50 мкл 70% этанола, приготовленного незадолго до использования, а затем центрифугируют в течение 2 минут. Осадок следует высушить, оставив пробирку открытой на столе рядом с соплом Бузена. После этого ресуспендируют в 40 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) + 10 мкг/мл РНКазы и оставляют на водяной бане при 37°С на 30 минут. Пять мкл образца будут использоваться для проверки качества и оценки количества ДНК в 0,8-1,0% агарозный гель. Известный стандарт массы (pGEM) будет работать вместе.

    ПЦР в реальном времени НАНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ: Будут использоваться специальные праймеры для Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia и A. actinomycetemcomitans. Все праймеры проверяются на специфичность путем проверки кривой плавления (полученной после запуска в LightCycler) и использования геля для проверки продукта.

    ОПТИМИЗАЦИЯ РЕАКЦИЙ: Для использования SYBR Green I требуются специальные продукты ПЦР, чтобы эффективность реакций праймеров была оптимизирована до начала самих реакций. Концентрации от 2 до 5 мМ MgCl2 и от 0,2 до 0,5 мкМ каждого праймера будут использоваться, чтобы определить, при каких условиях реакция будет иметь наибольшую эффективность. Условия, рекомендованные производителем оборудования.

    Реакции ОТ-ПЦР: Реакции ОТ-ПЦР будут проводиться с помощью системы LightCycler с использованием набора FastStart DNA Master SYBR Green I. Профиль реакции будет определяться в соответствии с рекомендациями производителя оборудования. Для каждого из «прогонов» вода будет использоваться в качестве отрицательного контроля, а продукт реакции будет количественно определен с использованием собственной программы производителя.

11. Иммуноферментный тест (платформа Luminex / MAGpix)

    Сбор жидкости десневой борозды (GCF) будет выполняться на исходном уровне, через 15, 45 дней, 3, 6 месяцев и 1 год после исследования одним и тем же исследователем. Для этого будут использоваться зубы и грани, ранее выбранные для хирургического этапа. Во время сбора материала пораженный участок будет должным образом изолирован и высушен стерилизованными ватными валиками. Наддесневая часть бактериальной биопленки будет удалена для получения образцов GCF путем помещения бумажных полосок на поверхность раздела зуб/ткань пародонта на 30 секунд. Две полоски бумаги на участок будут использоваться для получения подходящих, и бумажные полоски затем будут помещены в микроцентрифужные пробирки, кодированные для каждого отдельного и экспериментального периодов 150 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 0,05% Tween-20. Образцы будут храниться для дальнейшего анализа.

    Перед анализом образцы жидкости будут разбавлены 60 мкл буфера из набора Millipore, встряхнуты в течение 30 минут, а затем центрифугированы в течение 10 минут при 10 000 об/мин. Аликвоты каждого образца GCF будут проанализированы на предмет обнаружения костных маркеров (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH и RANKL) с помощью технологии Luminex/MAGpix. Для этого анализы будут проводиться в 96-луночных планшетах с помощью высокочувствительных панелей в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, лунки промывают промывочным буфером и аспирируют. В лунки будут добавлены эксклюзивные микросферы, конъюгированные с моноклональными антителами против различных анализируемых веществ (полистирольные микросферы окрашиваются в точном соотношении двух флуорофоров, создавая «цветовой код» для дальнейшей идентификации с помощью прибора Luminex / MAGpix). Образцы и реагенты для стандартной кривой будут пипетированы в лунки и инкубированы в течение ночи при 4°C. Затем лунки промывают и добавляют смесь вторичных антител. После инкубации в течение 1 часа окончательное обнаружение проводят с помощью третьей флуоресцентной метки, стрептавидин-фикоэритрина (ФЭ), связанной с антителом для обнаружения. Оборудование Luminex / MAGpix будет перемещать эти шарики одним файлом через пучки двух разных лазеров на проточном цитометре. Первый лазерный луч обнаружит (классифицирует) микросферу (цветовой код теста), а второй лазер будет количественно определять отчетный сигнал в каждой микросфере. Образцы будут анализироваться по отдельности, и их концентрации будут оцениваться по стандартной кривой с использованием полиномиального уравнения с использованием программного обеспечения Xponent. Средние концентрации каждого маркера будут выражены в пг/мкл. Пробы с количественным определением ниже предела обнаружения анализа должны быть записаны как «ноль», а образцы выше предела количественного определения стандартной кривой должны быть записаны равными наибольшему значению кривой.

12. Анализ результатов Анализ результатов будет проводиться с помощью описательной статистики с использованием таблиц и графиков, содержащих абсолютные и относительные частоты, а также параметры среднего и стандартного отклонения. Сравнение количественных переменных будет выполнено с помощью дисперсионного анализа и теста Тьюки. Качественные переменные будут сравниваться с использованием критерия хи-квадрат. Проверка корреляции между переменными будет осуществляться с помощью коэффициента корреляции Пирсона и Спирмена. Во всех тестах будет принят уровень значимости 5%.