Emaljematrixproteiner til behandling af intrabony defekter hos patienter med aggressiv og kronisk paradentose

Generel arbejdsplan og eksperimentel metodik

1. Prøvevalg

   Efter indsendelse og godkendelse af dette projekt til den forskningsetiske komité (CEP) af Piracicaba Dental School - UNICAMP, vil blive udvalgt blandt de patienter, der søger spontan behandling i klinikker efter graduate FOP-UNICAMP (hvor også vil blive udført den kliniske fase af undersøgelsen), 45 patienter i henhold til inklusionskriterierne

2. Prøveudtagningsberegning

   Den nødvendige stikprøvestørrelse for hver gruppe blev beregnet under hensyntagen til det kliniske tilknytningsniveau (CAL) som den primære variabel. For at detektere en forskel på 1 mm med 5 % alfa mellem grupperne, i betragtning af en standardafvigelse på 1 mm fejl og 80 % teststyrke, kræves der mindst 12 patienter i hver gruppe. I betragtning af at nogle patienter kan gå tabt under opfølgningen, vil 15 patienter blive inkluderet i denne undersøgelse.

3. Randomisering og blinding

   Undersøgeren vil være blind for behandlingerne. Dette opnås ved at fastslå, at vurderingerne er foretaget af en fagperson, der ikke er involveret i behandlingen. Opdelingen af ​​patienter i en gruppe bør ske ved lodtrækning for at være en helt tilfældig stikprøve, hvor behandlinger fordeles tilfældigt blandt patienterne. Brune kuverter vil blive brugt, på tidspunktet for det kirurgiske indgreb, indeholdende information fra behandlingsgruppen, der blev genereret gennem et edb-system.

4. Studere design

   Der vil blive gennemført en parallel undersøgelse på 45 patienter med en varighed på et år. De udvalgte patienter vil blive opdelt i 3 grupper, hvis tænder vil modtage de foreslåede behandlinger, som følger:

   • Group GAP Surgical Access (GAP + OFD, 15 patienter) - Patienter diagnosticeret med generaliseret aggressiv parodontitis (PAG), hvor den tidligere valgte intrabony defekt vil modtage, vil modtage åben flap debridement.
   • Group GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 patienter) - Patienter med diagnosen generaliseret aggressiv parodontitis (PAG), hvor den tidligere valgte intrabony defekt vil modtage åben flap debridement og derudover påføring af EMD i defekten.
   • Gruppe GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 patienter) - Patienter med diagnosen generaliseret kronisk parodontitis (PCG), hvor den tidligere valgte intrabony defekt vil modtage åben klap debridement og derudover påføring af EMD i defekten.

5. Præ-kirurgisk fase

   Indledende undersøgelse: Udvælgelse af patienter efter forud fastsatte kriterier.

   Indledende terapi: Alle patienter vil blive uddannet om årsager og konsekvenser af paradentose samt om forebyggende teknikker, herunder teknik til sulkulær børstning og tandtråd. Enkeltpersoner vil få bløde børster i forbindelse med en fluortandpasta, som vil blive genopfyldt efter behov. Professionel fjernelse af biofilm og supragingival calculus vil blive udført, samt biofilm retentionsfaktorer, hvis nødvendigt.

   Behandling: Afskalning og rodhøvling af alle de tænder, der giver en indikation. Efter den aktive fase af behandlingen vil patienterne blive inkluderet i understøttende terapi med kontrol hver anden uge i den første måned og månedligt indtil afslutningen af ​​undersøgelsen, indeholdende hygiejneorientering, profylakse og kvartalsvis genbehandling af tænder, der har en sonderingsdybde større end 5 mm, med BoP.

6. Kirurgisk fase

   Tænder, der har en resterende sonderingsdybde ≥ 6 mm forbundet med radiografiske beviser for intraboby-effekter, i henhold til inklusionskriterierne nævnt ovenfor, vil blive inkluderet i den kirurgiske procedure. Regenerative procedurer vil kun blive planlagt, når alle nødvendige ikke-kirurgiske procedurer udføres samtidig med passende PI- og GI-niveauer på op til 20 %. Alle kirurgiske indgreb vil blive udført af den samme operatør. En time før behandlingen vil patienter modtage en enkelt dosis dexamethason 4 mg.

   Beskrivelse af teknikken: Efter administration af lokalbedøvelse hæves klapperne i fuld tykkelse for at få adgang til alle defekte ansigter. Sulkulære snit vil blive udført, der strækker sig til mesiale og distale tilstødende tænder, inklusive hele papillen i klappen. Der vil ikke blive udført afslappende snit. Alt granulationsvæv vil herefter forsigtigt blive fjernet, og efterfølgende vil der blive foretaget afskalning og rodhøvling. Det kirurgiske område vil blive skyllet med 0,9 % saltvand og omhyggeligt inspiceret for at sikre, at alle trin er blevet tilfredsstillende udført indtil da. Efter denne indledende fase af det kirurgiske indgreb vil defekterne blive randomiseret. For grupperne GAP + OFD/EMD og GCP + OFD/EMD vil der være anvendelse af EMD i defekten. Til dette bør den pågældende overflade være fri for spyt og blod. Dette stof påføres straks på den blottede rodoverflade. Påføringen vil begynde ved den mest apikale del af knogleniveauet indtil den totale dækning af defekten og rodoverfladen. Flapperne vil derefter blive genplaceret og sutureret passivt indtil den primære lukning af vævene.

   Postoperativ behandling: Patienterne vil blive instrueret i at tage analgetikum (natriumdipyron 500 mg hver 4. time i 2 dage) og chelatere 0,12 % klorhexidindigluconat (2 gange dagligt i 15 dage). Suturene vil blive fjernet efter 15 dage efter det kirurgiske indgreb. I den postoperative periode vil patienten blive bedt om at stoppe børstning og tandtråd i procedureområdet i 15 dage, hvor mundhygiejnevanerne vil blive genoptaget.

7. Klinisk evaluering

   Forkalibreringen af ​​undersøgeren til målingerne vil blive udført for at sikre pålideligheden af ​​de data, der er opnået gennem to undersøgelser, med et maksimalt interval på 48 timer mellem dem, hos 8 forskellige ikke-forskningspatienter. Kappa-indeks og intraklasse-korrelation vil blive brugt til at evaluere reproducerbarhed og overensstemmelse.

   Alle kliniske parametre vil blive opnået ved hjælp af en North Carolina-type parodontalsonde, ved baseline, 3, 6 måneder og 1 år derefter, ved hjælp af stents/individuelle akrylguider, lavet ud fra forudformede undersøgelsesmodeller af eksaminator.

   De evaluerede kliniske parametre vil være: Pladeindeks - PI; Blødning ved sondering - BoP; Gingival margin position - GMP: afstand fra stenten til den frie gingival margin; Relative Clinical Attachment Leval - rCAL: afstand fra stenten til den klinisk påviselige base af parodontallommen; Probing Depth - PD (rCAL - GMP): afstand fra tandkødsranden til den klinisk påviselige base af parodontallommen.

   På det transkirurgiske tidspunkt vil følgende målinger blive udført: Afstand mellem stentmarginen og den alveolære knoglekam (BC-ST); Afstand mellem den alveolære knoglekam og bunden af ​​defekten (BC-BD), der karakteriserer den lodrette komponent af intrabony defekten; Afstand fra den alveolære knogletop til rodoverfladen (BC-RS), der karakteriserer defektens vandrette komponent.

8. Patienttilfredshed og opfattelse af terapi

   Til vurdering af patientens opfattelse af det udførte indgreb og den postoperative periode, modtager de et spørgeskema 15 dage efter indgrebet. Omfanget af ubehag og/eller smerte oplevet under den transoperative periode vil blive evalueret ved hjælp af en 100 mm horisontal analog visuel skala (VAS), der spænder fra fravær til ekstrem. Patienterne vil også blive instrueret i at kvantificere mængden af ​​anvendt smertestillende middel. Herudover vil omfanget af ubehag, radikulær overfølsomhed, ødem, hæmatom, feber og indgreb i daglige aktiviteter i den første postoperative uge blive vurderet på samme måde. Efter 6 måneder af det kirurgiske indgreb vil der blive udleveret endnu et spørgeskema for at bestemme individernes opfattelse af resultaterne og graden af ​​tilfredshed med behandlingen. Spørgeskemaet vil bruge en forenklet skala til at registrere behandlingstilfredshed med hensyn til æstetisk udseende af den behandlede tand ved at vælge en af ​​følgende: Meget tilfreds, neutral, moderat tilfreds eller utilfreds. Derudover vil patienterne blive spurgt om deres opfattelse af resultaterne af terapi anvendt på de pågældende tænder med hensyn til forbedring af tandkødsblødninger, rødme, ødem og hygiejnemønster. Disse parametre vil også blive evalueret gennem VAS-skalaen, hvor 0 er ingen forbedring og 100 er den maksimale forbedring. Oral Health Impact Profile-14 (OHIP-14) vil også blive brugt for at få adgang til oral sundhedsrelateret livskvalitet, anvendt før operationen og 6 måneder senere. Dimensionerne af påvirkningen er: funktionsbegrænsning, fysisk smerte, psykisk ubehag, fysisk inhabilitet, psykisk inhabilitet og handicap til at udføre daglige aktiviteter. En tilpasning af Post-Surgical Patient Satisfaction Questionnaire (PSPSQ) vil også blive anvendt til at evaluere patientens tilfredshed med det kirurgiske indgreb i den postoperative periode på 15 dage og 6 måneder. Denne 3-punkts skala, med et svar fra 0 til 10 (0 = ikke ved 10 = totalt), er i stand til at evaluere patientens kort- og langsigtede tilfredshed i den postoperative periode.

9. Radiografisk vurdering[

   Periapikale røntgenbilleder af alle intrabony defekter vil blive udført ved baseline, efter 6 måneder og 1 år, ved brug af parallelisme teknikken, af den samme undersøger. Til standardisering af billederne vil der blive lavet okklusale optegnelser i kemisk aktiveret akrylharpiks med radiografiske positioneringsapparater. En standard ortodontisk ledning af kendt størrelse vil blive placeret på den okklusale støtte ved en bestemt position, og billedet af denne ledning vil blive opnået på røntgenbilleder til korrektion af lodret og vandret vinkling under analyserne.

   Røntgenbillederne vil blive udført af et digitalt system, der anvender fleksible og genanvendelige fosforopbevaringsplader (PSP; 31 mm x 41 mm). Valget af eksponeringstiden vil ske i henhold til tanden relateret til defekten, da det apparat, der skal bruges (Sommo røntgen af ​​mobil søjle, rør: 70 kV, 7 mA, brændvidde: 20 cm, specifikationer: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; har et semi-automatisk tandvalgssystem med etablerede eksponeringstider fra 0,32 til 0,40 sekunder. Til læsning af billederne vil der blive brugt en specifik scanner. De opnåede billeder vil derefter blive gemt i en computer indtil analyseøjeblikket. Standardopløsningen vil være 96x96 dpi og 32 bit. Alle billeder vil blive optaget i TIFF (.tif)-format. Radiografiske målinger af defekter vil blive udført ved hjælp af specifik software til billedanalyse. De radiografiske vinkler af defekterne vil blive evalueret og defineret af to linjer, der repræsenterer rodoverfladen og overfladen af ​​knogledefekten.

   Følgende lineære radiografiske parametre vil blive målt: cement-emalje forbindelsesafstand (CEJ) til bunden af ​​defekten (BD) (CEJ-BD); Afstand fra CEJ og den mere koronale del af den alveolære knoglekam (BC) (CEJ-BC); Afstand mellem BD og BC (BD-BC). Forskelle mellem værdierne fundet 6 måneder og 1 år postoperativt og baseline for CEJ-BD vil indikere mængden af ​​hårdvævsfyldning af den infra-ossøse defekt. Forskelle mellem CEJ-BC og BD-BC vil identificere henholdsvis mængden af ​​resorption af knoglekammen og dybden af ​​den intrabony defekt

10. Mikrobiologisk vurdering

    Den mikrobiologiske evaluering vil blive udført gennem polymerasekædereaktionen (PCR) af realtidstypen. Denne test vil muliggøre kvantitativ påvisning af følgende bakterier: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro og P. intermedia.

    Subgingival biofilmprøver vil blive udført ved baseline, 3, 6 måneder og 1 år efter den kirurgiske procedure, af den samme undersøger. For at gøre dette vil de tænder og ansigter, der tidligere er valgt til den kirurgiske fase, blive brugt. Området vil blive ordentligt isoleret med steriliserede bomuldsruller. Den supragingivale del af biofilmen vil blive fjernet, og derefter vil prøver af den subgingivale biofilm blive opnået ved at placere sterile absorberende papirkegler inde i lommen. Efter 30 sekunder fjernes papirkeglerne og placeres i mikrocentrifugerør med Tris-EDTA-opløsning, kodet for hver patient. Eppendorfs skal holdes ved -20 °C, indtil testen udføres.

    Til DNA-ekstraktion vil mikrorørene blive vortexet og papirkeglerne fjernet med klinisk klemmehjælp. Prøver vil blive centrifugeret til fjernelse af supernatanten. 700 µL ekstraktionsbuffer tilsættes, omrystes yderligere og placeres i et vandbad i 30 minutter ved 65 ° C. Næste trin vil være at tilsætte 650 μl CIA, homogenisere til en emulsion (20 gange) og centrifugere ved 12.000-15.000 rpm for 7 minutter. Den vandige fase vil blive overført til et nyt 1,5 ml mikrorør, hvortil 200 µL ekstraktionsbuffer uden proteinase K vil blive tilsat. Homogenisering vil derefter blive udført for tilsætning af 650 µL CIA. Yderligere homogenisering og centrifugering ved 12.000-15.000 rpm fortsættes i 7 minutter. Den vandige fase vil blive overført til et nyt rør, hvortil 650 μl CIA vil blive tilsat, efterfulgt af centrifugering ved 12.000-15.000 rpm i 7 minutter (gentag to gange mere, hvis det er nødvendigt). DNA'et vil blive præcipiteret med 1 volumen isopropanol ved stuetemperatur, derefter homogeniseret (20 gange) og centrifugeret ved 12.000-15.000 rpm i 7 minutter. Overfladen af ​​bundfaldet vaskes én gang med 50 μl 70 % ethanol, der er fremstillet kort før brug og derefter centrifugeret i 2 minutter. Bundfaldet skal tørres, så røret efterlades åbent på bænken ved siden af ​​Busens dyse. Derefter udføres resuspension i 40 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) + 10 μg / ml RNAse og efterlades i et vandbad ved 37 ° C i 30 minutter. Fem μL af prøven vil blive brugt til at kontrollere kvaliteten og estimere mængden af ​​DNA i en 0,8-1,0 % agarose gel. En kendt massestandard (pGEM) vil køre sammen.

    Realtids-PCR-TEGNING AF PRIMERE: Specifikke primere for Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia og A. actinomycetemcomitans vil blive brugt. Alle primere vil blive kontrolleret for specificitet ved at kontrollere smeltekurven (opnået efter kørsel i LightCycler) og løbegelen til produktverifikation.

    OPTIMERING AF REAKTIONER: Anvendelsen af ​​SYBR Green I kræver specifikke PCR-produkter, således at effektiviteten af ​​primerreaktionerne bliver optimeret forud for påbegyndelsen af ​​selve reaktionerne. Koncentrationer fra 2 til 5 mM MgCl2 og fra 0,2 til 0,5 μM af hver primer vil blive brugt til at bestemme, under hvilke betingelser reaktionen ville have den bedste effektivitet. Betingelser foreslået af udstyrsproducenten.

    RT-PCR-reaktioner: RT-PCR-reaktioner udføres med LightCycler-systemet ved hjælp af FastStart DNA Master SYBR Green I-sættet. Reaktionsprofilen vil blive bestemt efter udstyrsproducentens anbefalinger. Til hver af "kørslerne" vil vandet blive brugt som negativ kontrol, og reaktionsproduktet vil blive kvantificeret ved hjælp af producentens eget program.

11. Immunoenzymatisk test (Luminex platform / MAGpix)

    Gingival Crevicular Fluid (GCF) opsamlinger vil blive udført ved baseline, 15, 45 dage, 3, 6 måneder og 1 år efter undersøgelsen, af den samme eksaminator. For at gøre dette vil de tænder og ansigter, der tidligere er valgt til den kirurgiske fase, blive brugt. Under indsamling af materialet vil det involverede sted blive ordentligt isoleret og tørret med steriliserede bomuldsruller. Den supragingivale del af den bakterielle biofilm vil blive fjernet for at opnå GCF-prøver ved at placere papirstrimler inden for grænsefladen mellem tand/parodontale væv i 30 sekunder. To strimler papir pr. sted vil blive brugt til at opnå passende, og papirstrimlerne vil derefter blive placeret i mikrocentrifugerør, kodet for hver individuelle og eksperimentelle perioder med 150 μl fosfatbufret saltvand (PBS) og 0,05% Tween-20. Prøverne vil blive opbevaret til yderligere analyse.

    Før analyse vil væskeprøverne blive fortyndet i 60 μl buffer fra Millipore-kittet, vortexet i 30 minutter og derefter centrifugeret i 10 minutter ved 10.000 rpm. Alikvoter af hver GCF-prøve vil blive analyseret til påvisning af knoglemarkører (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH og RANKL) ved hjælp af Luminex / MAGpix-teknologi. For at gøre dette vil analyserne blive udført i plader med 96 brønde ved hjælp af paneler med høj følsomhed efter producentens anvisninger. Kort fortalt vil brøndene blive vasket med vaskebuffer og aspireret. Eksklusive mikrosfærer konjugeret til monoklonale antistoffer mod de forskellige analytter, der skal analyseres, vil blive tilføjet til brøndene (polystyren-mikrosfærerne farves med præcise proportioner af to fluoroforer, hvilket skaber en "farvekode" til yderligere identifikation af Luminex / MAGpix-instrumentet). Prøver og reagenser til standardkurven pipetteres i brøndene og inkuberes natten over ved 4oC. Brøndene vil derefter blive vasket, og en blanding af sekundære antistoffer vil blive tilføjet. Efter inkubation i 1 time vil den endelige påvisning ske gennem et tredje fluorescerende mærke, Streptavidin-Phycoerythrin (PE) bundet til detektionsantistoffet. Luminex / MAGpix-udstyret vil flytte disse perler i en enkelt fil gennem bundter af to forskellige lasere på et flowcytometer. Den første laserstråle vil detektere (klassificere) mikrosfæren (farvekoden for testen), og den anden laser vil kvantificere rapporteringssignalet i hver mikrosfære. Prøver vil blive analyseret individuelt, og deres koncentrationer vil blive estimeret ud fra en standardkurve ved hjælp af en polynomialligning ved hjælp af Xponent-software. De gennemsnitlige koncentrationer af hver markør vil blive udtrykt i pg/μl. Prøver med kvantificering under analysens detektionsgrænse skal registreres som "nul", og prøver over standardkurvens kvantificeringsgrænse skal registreres lig med kurvens højeste værdi.

12. Analyse af resultater Analysen af ​​resultaterne vil blive udført gennem beskrivende statistik ved hjælp af tabeller og grafer, der indeholder absolutte og relative frekvenser og parametre for middelværdi og standardafvigelse. Sammenligningen af ​​de kvantitative variable vil ske gennem variansanalyse og Tukeys test. Kvalitative variabler vil blive sammenlignet ved hjælp af chi-kvadrattesten. Korrelationstjekket mellem variablerne vil blive udført gennem Pearson og Spearman korrelationskoefficienten. I alle tests vil der blive anvendt et signifikansniveau på 5 %.