공격성 및 만성 치주염 환자의 골내 결손 치료에서 법랑질 기질 단백질

일반적인 작업 계획 및 실험 방법론

1. 샘플 선택

   Piracicaba Dental School - UNICAMP의 연구 윤리 위원회(CEP)에 이 프로젝트를 제출하고 승인한 후, FOP-UNICAMP 졸업 후 클리닉에서 자발적인 치료를 원하는 환자 중에서 선택됩니다(여기에서 임상 단계도 수행됩니다. 연구), 포함 기준에 따라 45명의 환자

2. 샘플링 미적분학

   각 그룹에 필요한 샘플 크기는 임상 애착 수준(CAL)을 1차 변수로 고려하여 계산되었습니다. 1mm 오차와 80% 검정력의 표준 편차를 고려하여 그룹 간 5% 알파로 1mm의 차이를 감지하려면 각 그룹에 최소 12명의 환자가 필요합니다. 일부 환자가 추적 관찰 중 소실될 수 있음을 고려하여 15명의 환자를 본 연구에 포함시킨다.

3. 무작위화 및 눈가림

   심사관은 치료에 눈이 멀 것입니다. 이것은 평가가 치료에 관여하지 않는 전문가에 의해 이루어짐을 결정함으로써 달성됩니다. 환자를 그룹으로 나누는 것은 완전히 무작위 표본이 되도록 추첨으로 이루어져야 하며 치료는 환자들에게 무작위로 분배됩니다. 컴퓨터 시스템을 통해 생성된 치료 그룹의 정보가 포함된 갈색 봉투가 수술 시 사용됩니다.

4. 연구 설계

   1년 동안 45명의 환자를 대상으로 병렬 연구가 수행됩니다. 선택된 환자는 다음과 같이 제안된 치료를 받을 치아가 있는 3개 그룹으로 나뉩니다.

   • Group GAP Surgical Access (GAP + OFD, 15명의 환자) - 기존에 선택한 골내 결손이 받을 전신 공격성 치주염(PAG) 진단을 받은 환자는 개방형 플랩 괴사 조직 절제술을 받게 됩니다.
   • Group GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15명의 환자) - 이전에 선택한 골내 결손에 대해 PAG(범발성 공격성 치주염) 진단을 받은 환자에서 개방형 플랩 조직 제거술과 함께 EMD를 적용합니다. 결함에.
   • Group GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15명 환자) - 전신 만성 치주염(PCG) 진단을 받은 환자로, 이전에 선택한 골내 결손에 개방피판 괴사조직 절제술을 시행하고 추가로 EMD를 적용합니다. 결함에.

5. 수술 전 단계

   초기 검사: 미리 설정된 기준에 따라 환자를 선택합니다.

   초기 치료: 모든 환자는 치주 질환의 원인과 결과뿐만 아니라 열구 칫솔질 및 치실 사용 기술을 포함한 예방 기술에 대해 교육을 받습니다. 개인에게는 불소 치약과 함께 부드러운 칫솔이 제공되며 필요에 따라 보충됩니다. 생물막 및 치은연상 결석의 전문적인 제거는 물론 필요한 경우 생물막 유지 인자도 수행됩니다.

   치료: 적응증을 나타내는 모든 치아의 스케일링 및 치근 활택술. 치료의 활성 단계 후, 환자는 위생 방향, 예방 및 프로빙 깊이가 더 큰 치아의 분기별 재치료를 포함하는 연구가 끝날 때까지 첫 달 및 매월 격주 제어로 지지 요법에 포함됩니다. 5mm, BoP 포함.

6. 수술 단계

   위에서 언급한 포함 기준에 따라 신체 내 손상의 방사선학적 증거와 관련하여 잔여 프로빙 깊이 ≥ 6mm를 나타내는 치아가 수술 절차에 포함됩니다. 재생 절차는 필요한 모든 비외과적 절차가 최대 20%의 적절한 PI 및 GI 수준과 동시에 수행되는 경우에만 예약됩니다. 모든 수술 절차는 동일한 시술자에 의해 수행됩니다. 치료 1시간 전에 환자는 덱사메타손 4mg을 1회 투여받습니다.

   기술 설명: 국소 마취제를 투여한 후 모든 결손면에 접근하기 위해 전층 피판을 올립니다. 열구 절개는 플랩의 전체 유두를 포함하여 근심 및 원위 인접 치아까지 연장됩니다. 편안한 절개는 시행되지 않습니다. 그런 다음 모든 육아 조직을 조심스럽게 제거한 다음 스케일링 및 루트 플래닝을 수행합니다. 수술 부위를 0.9% 식염수로 관개하고 주의 깊게 검사하여 그때까지 모든 단계가 만족스럽게 수행되었는지 확인합니다. 수술 절차의 이 초기 단계 후에 결함은 무작위로 분류됩니다. GAP + OFD/EMD 및 GCP + OFD/EMD 그룹의 경우 결함에 EMD가 적용됩니다. 이를 위해 해당 표면에 타액과 혈액이 없어야 합니다. 이 물질은 노출된 뿌리 표면에 즉시 적용됩니다. 적용은 결함과 치근 표면의 전체 적용 범위까지 뼈 수준의 가장 정점 부분에서 시작됩니다. 플랩은 조직의 1차 폐쇄까지 수동적으로 재배치되고 봉합됩니다.

   수술 후 관리: 환자에게 진통제(2일 동안 4시간마다 나트륨 디피론 500mg) 및 킬레이트 0.12% 클로르헥시딘 디글루코네이트(15일 동안 하루 2회)를 복용하도록 지시합니다. 봉합사는 수술 후 15일 후에 제거됩니다. 수술 후 기간 동안 환자는 구강 위생 습관이 재개되는 15일 동안 시술 부위에서 칫솔질과 치실 사용을 중단하도록 요청받을 것입니다.

7. 임상 평가

   측정을 위한 검사자의 사전 보정은 8명의 서로 다른 비연구 환자에서 최대 48시간 간격으로 두 검사를 통해 얻은 데이터의 신뢰성을 보장하기 위해 수행됩니다. Kappa 지수와 클래스 내 상관관계를 사용하여 재현성과 일치도를 평가합니다.

   모든 임상 매개변수는 기준선, 3, 6개월 및 1년 후 North Carolina 유형의 치주 탐침을 사용하여 검사자가 미리 만든 연구 모델로 만든 스텐트/개별 아크릴 가이드를 사용하여 얻을 수 있습니다.

   평가되는 임상 매개변수는 다음과 같습니다: Plate Index - PI; 프로빙 시 출혈 - BoP; 치은 변연 위치 - GMP: 스텐트에서 자유 치은 변연까지의 거리; Relative Clinical Attachement Leval - rCAL: 스텐트에서 치주낭의 임상적으로 감지 가능한 베이스까지의 거리; 탐침 깊이 - PD(rCAL - GMP): 치은 변연에서 임상적으로 감지할 수 있는 치주낭 기저부까지의 거리.

   경수술 시간에 다음 측정이 수행됩니다: 스텐트 마진과 치조골 마루 사이의 거리(BC-ST); 골내 결손의 수직 성분을 특징짓는 치조골 마루와 결손 기저부(BC-BD) 사이의 거리; 결함의 수평 구성요소를 특징짓는 치조골 마루에서 치근 표면(BC-RS)까지의 거리.

8. 치료에 대한 환자 만족도 및 인식

   수행된 절차 및 수술 후 기간에 대한 환자의 인식을 평가하기 위해 절차 후 15일 후에 설문지를 받게 됩니다. 수술 전 기간 동안 경험한 불편함 및/또는 통증의 정도는 100mm 수평 아날로그 시각 척도(VAS)를 사용하여 부재에서 극한까지 범위로 평가됩니다. 환자는 또한 사용된 진통제의 양을 정량화하도록 지시받을 것입니다. 또한 수술 후 1주 동안 불편감, 신경근 과민증, 부종, 혈종, 발열, 일상생활 방해 정도 등을 같은 방법으로 평가한다. 수술 후 6개월 후, 결과에 대한 개인의 인식과 치료에 대한 만족도를 알아보기 위해 또 다른 설문지가 전달될 것입니다. 설문지는 다음 중 하나를 선택하여 치료된 치아의 미적 외관 측면에서 치료 만족도를 기록하기 위해 단순화된 척도를 사용합니다: 매우 만족, 보통, 보통 만족 또는 불만족. 또한 잇몸 출혈, 발적, 부종 및 위생 패턴의 개선 측면에서 해당 치아에 적용된 치료 결과에 대한 환자의 인식에 대해 질문합니다. 이러한 매개변수는 VAS 척도를 통해 평가되며, 0은 개선되지 않았으며 100은 최대 개선입니다. 구강 건강 영향 프로파일-14(OHIP-14)는 또한 수술 전과 6개월 후에 적용되는 구강 건강 관련 삶의 질에 접근하기 위해 사용될 것입니다. 영향의 차원은 기능 제한, 신체적 고통, 심리적 불편함, 신체적 무능력, 심리적 무능력 및 일상 활동 수행 장애입니다. 수술 후 환자 만족도 설문지(PSPSQ)를 개작하여 수술 후 15일 6개월 동안 수술에 대한 환자의 만족도를 평가할 예정입니다. 이 3항목 척도는 0에서 10(0 = 아님 10 = 완전히)의 응답으로 수술 후 기간에 환자의 단기 및 장기 만족도를 평가할 수 있습니다.

9. 방사선학적 평가[

   모든 골내 결함에 대한 치근단 방사선 사진은 기준선에서 6개월 및 1년 후에 동일한 검사자에 의해 병렬 기술을 사용하여 수행됩니다. 이미지의 표준화를 위해 방사선 포지셔너를 사용하여 화학적으로 활성화된 아크릴 수지에 교합 기록을 만들 것입니다. 알려진 크기의 표준 교정용 와이어를 특정 위치의 교합 지지대에 배치하고 이 와이어의 이미지를 방사선 사진에서 얻어 분석하는 동안 수직 및 수평 각도를 교정합니다.

   X선은 유연하고 재사용 가능한 형광체 저장판(PSP; 31mm x 41mm)을 사용하는 디지털 시스템에서 수행됩니다. 노출 시간의 선택은 사용할 장치(이동 컬럼의 Sommo X-ray, 튜브: 70kV, 7mA, 초점 거리: 20cm, 사양: 800- 1200 VA, 50-60 Hz, 0.32에서 0.40초 범위의 노출 시간을 설정한 반자동 치아 선택 시스템이 있습니다. 이미지를 읽기 위해 특정 스캐너가 사용됩니다. 얻은 이미지는 분석 시점까지 컴퓨터에 저장됩니다. 기본 해상도는 96x96dpi 및 32비트입니다. 모든 이미지는 TIFF(.tif) 형식으로 기록됩니다. 결함의 방사선 사진 측정은 이미지 분석을 위한 특정 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 결함의 방사선 촬영 각도는 치근 표면과 뼈 결함 표면을 나타내는 두 개의 선으로 평가되고 정의됩니다.

   다음과 같은 선형 방사선 사진 매개변수가 측정됩니다. CEJ와 치조골 능선(BC)의 더 치관부로부터의 거리(CEJ-BC); BD와 BC 사이의 거리(BD-BC). 수술 후 6개월 및 1년에 발견된 값과 CEJ-BD의 기준선 사이의 차이는 골하 결함의 경조직 충진량을 나타냅니다. CEJ-BC와 BD-BC의 차이점은 각각 뼈 능선의 재흡수량과 골내 결함의 깊이를 식별합니다.

10. 미생물학적 평가

    미생물 평가는 실시간 방식의 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 이뤄진다. 이 테스트를 통해 P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro 및 P. intermedia와 같은 박테리아를 정량적으로 검출할 수 있습니다.

    치은연하 생물막 샘플은 기준선, 수술 후 3, 6개월 및 1년에 동일한 심사관에 의해 수행됩니다. 이를 위해 수술 단계에 대해 이전에 선택된 치아와 얼굴이 사용됩니다. 해당 지역은 멸균 면봉으로 적절하게 절연됩니다. 생물막의 치은 상부 부분을 제거한 다음 포켓 내부에 멸균 흡수지 콘을 배치하여 치은 하부 생물막의 샘플을 채취합니다. 30초 후 종이 콘을 제거하고 각 환자에 대해 코딩된 Tris-EDTA 용액이 담긴 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 에펜도르프는 테스트가 수행될 때까지 -20°C에서 유지되어야 합니다.

    DNA 추출을 위해 마이크로튜브는 와동되고 페이퍼 콘은 임상 클램프 보조 장치로 제거됩니다. 상청액을 제거하기 위해 샘플을 원심분리합니다. 700µL 추출 버퍼를 추가하고 추가로 흔들고 65°C에서 30분 동안 수조에 넣습니다. 다음 단계는 650µl CIA를 추가하고 에멀젼에 균질화(20회)하고 12,000-15,000rpm에서 원심분리하는 것입니다. 7분. 수성상을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고 여기에 200µL의 프로테이나제 K가 없는 추출 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 650µL CIA를 추가하기 위해 균질화가 수행됩니다. 12,000-15,000 rpm에서 추가 균질화 및 원심분리를 7분 동안 계속합니다. 수성상을 새 튜브로 옮기고 여기에 650 μl CIA를 첨가한 다음 12,000-15,000 rpm에서 7분 동안 원심분리합니다(필요한 경우 2회 더 반복). DNA는 실온에서 1 부피의 이소프로판올로 침전된 다음 균질화(20회)되고 12,000-15,000 rpm에서 7분 동안 원심분리됩니다. 사용 직전에 준비한 70% 에탄올 50μl로 침전물의 표면을 1회 세척한 후 2분 동안 원심분리한다. Busen의 노즐 옆 벤치에 튜브를 열어 둔 채 침전물을 건조시켜야 합니다. 그 후, 40μL TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0) + 10μg/mL RNAse에 재현탁하고 37℃ 수조에서 30분간 방치한다. 5 μL의 샘플을 사용하여 품질을 확인하고 0.8-1.0%의 DNA 양을 추정합니다. 아가로스 젤. 알려진 질량 표준(pGEM)이 함께 실행됩니다.

    프라이머의 실시간 PCR 도면: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia 및 A. actinomycetemcomitans에 대한 특정 프라이머가 사용됩니다. 모든 프라이머는 제품 확인을 위해 용융 곡선(LightCycler에서 실행한 후 획득) 및 실행 젤을 확인하여 특이성을 확인합니다.

    반응 최적화: SYBR Green I을 사용하려면 특정 PCR 제품이 필요하므로 반응 자체가 시작되기 전에 프라이머 반응의 효율성이 최적화됩니다. 2 ~ 5mM MgCl2 및 0.2 ~ 0.5μM 범위의 각 프라이머 농도를 사용하여 어떤 조건에서 반응이 가장 효율적일지 결정합니다. 장비 제조업체에서 제안하는 조건입니다.

    RT-PCR 반응: RT-PCR 반응은 FastStart DNA Master SYBR Green I 키트를 사용하여 LightCycler 시스템으로 수행됩니다. 반응 프로필은 장비 제조업체의 권장 사항에 따라 결정됩니다. 각각의 "실행"에 대해 물은 음성 대조군으로 사용되며 반응 생성물은 제조업체 자체 프로그램을 사용하여 정량화됩니다.

11. 면역효소검사(루미넥스 플랫폼 / MAGpix)

    GCF(Gingival Crevicular Fluid) 수집은 연구 후 기준선, 15, 45일, 3, 6개월 및 1년에 동일한 심사관에 의해 수행됩니다. 이를 위해 수술 단계에 대해 이전에 선택된 치아와 얼굴이 사용됩니다. 재료를 수집하는 동안 관련 부위를 적절하게 절연하고 멸균된 면봉으로 건조합니다. 종이 스트립을 치아/치주 조직 경계면에 30초 동안 배치하여 GCF 샘플을 얻기 위해 박테리아 생물막의 치은연상 부분을 제거합니다. 사이트당 두 장의 종이 조각을 사용하여 적합한 것을 얻은 다음 종이 조각을 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 각 개별 및 실험 기간에 대해 150μl의 인산염 완충 식염수(PBS)와 0.05% Tween-20으로 코딩합니다. 샘플은 추가 분석을 위해 저장됩니다.

    분석 전에 유체 샘플을 Millipore 키트의 버퍼 60μl로 희석하고 30분 동안 vortex한 다음 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리합니다. Luminex/MAGpix 기술로 각 GCF 샘플의 분취량을 분석하여 골 표지자(PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH 및 RANKL)를 검출합니다. 이를 위해 제조업체의 지침에 따라 고감도 패널의 도움으로 96개의 웰 플레이트에서 분석을 수행합니다. 간략하게, 웰은 세척 버퍼로 세척되고 흡인됩니다. 분석할 다양한 분석물에 대한 단클론 항체에 접합된 전용 마이크로스피어가 웰에 추가됩니다(폴리스티렌 마이크로스피어는 두 개의 형광단의 정확한 비율로 염색되어 Luminex/MAGpix 기기로 추가 식별을 위한 "색상 코드"를 생성함). 표준 곡선에 대한 샘플 및 시약은 웰에 피펫으로 옮겨지고 4oC에서 밤새 배양됩니다. 그런 다음 웰을 세척하고 이차 항체의 혼합물을 추가합니다. 1시간 동안 배양한 후 최종 검출은 검출 항체에 결합된 세 번째 형광 라벨인 Streptavidin-Phycoerythrin(PE)을 통해 수행됩니다. Luminex/MAGpix 장비는 유세포 분석기에서 두 개의 서로 다른 레이저 번들을 통해 이러한 비드를 단일 파일로 이동합니다. 첫 번째 레이저 빔은 마이크로스피어(테스트용 색상 코드)를 감지(분류)하고 두 번째 레이저는 각 마이크로스피어의 보고 신호를 정량화합니다. 샘플은 개별적으로 분석되고 농도는 Xponent 소프트웨어를 사용하는 다항 방정식을 사용하여 표준 곡선에서 추정됩니다. 각 마커의 평균 농도는 pg/μl로 표시됩니다. 분석 검출 한계 미만의 정량화 샘플은 "0"으로 기록하고 표준 곡선의 정량화 한계 이상의 샘플은 곡선의 최고값과 동일하게 기록해야 합니다.

12. 결과 분석 결과 분석은 절대 및 상대 빈도와 평균 및 표준 편차의 매개 변수를 포함하는 표와 그래프를 사용하여 기술 통계를 통해 수행됩니다. 정량적 변수의 비교는 분산분석과 Tukey's test를 통해 이루어진다. 질적 변수는 카이 제곱 테스트를 사용하여 비교됩니다. 변수 간의 상관관계 확인은 Pearson과 Spearman 상관계수를 통해 이루어집니다. 모든 테스트에서 5%의 유의 수준이 채택됩니다.