Proteínas de la matriz del esmalte en el tratamiento de defectos intraóseos en pacientes con periodontitis crónica y agresiva

Plan general de trabajo y metodología experimental

1. Selección de muestras

   Después de la presentación y aprobación de este proyecto al Comité de Ética en Investigación (CEP) de la Facultad de Odontología de Piracicaba - UNICAMP, serán seleccionados entre los pacientes que buscan espontáneamente tratamiento en las clínicas de posgrado FOP-UNICAMP (donde también se realizará la fase clínica de el estudio), 45 pacientes según los criterios de inclusión

2. Cálculo de muestreo

   El tamaño de muestra requerido para cada grupo se calculó considerando el nivel de apego clínico (CAL) como variable principal. Para detectar una diferencia de 1 mm con 5% alfa entre grupos, considerando una desviación estándar de 1 mm de error y 80% de poder de prueba, se requerirán al menos 12 pacientes en cada grupo. Teniendo en cuenta que algunos pacientes pueden perderse durante el seguimiento, se incluirán 15 pacientes en el presente estudio.

3. Aleatorización y cegamiento

   El examinador estará ciego a los tratamientos. Esto se logra determinando que las valoraciones sean realizadas por un profesional ajeno al tratamiento. La división de los pacientes en un grupo debe hacerse por sorteo para que sea una muestra totalmente aleatoria, con tratamientos distribuidos al azar entre los pacientes. Se utilizarán sobres marrones, en el momento del procedimiento quirúrgico, conteniendo la información del grupo de tratamiento que fue generada a través de un sistema computarizado.

4. Diseño del estudio

   Se realizará un estudio paralelo en 45 pacientes, con una duración de un año. Los pacientes seleccionados serán divididos en 3 grupos, cuyos dientes recibirán los tratamientos propuestos, así:

   • Grupo GAP Acceso Quirúrgico (GAP + OFD, 15 pacientes) - Los pacientes diagnosticados con periodontitis agresiva generalizada (PAG), en los que el defecto intraóseo previamente seleccionado recibirá un desbridamiento con colgajo abierto.
   • Grupo GAP Acceso Quirúrgico + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 pacientes) - Pacientes con diagnóstico de periodontitis agresiva generalizada (PAG), en los que el defecto intraóseo previamente seleccionado recibirá desbridamiento con colgajo abierto y, además, aplicación del EMD en el defecto.
   • Grupo GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 pacientes) - Pacientes con diagnóstico de periodontitis crónica generalizada (PCG), en los que el defecto intraóseo previamente seleccionado recibirá desbridamiento con colgajo abierto y, además, aplicación de EMD en el defecto.

5. Fase prequirúrgica

   Exploración inicial: Selección de pacientes según criterios preestablecidos.

   Terapia Inicial: Todos los pacientes serán educados sobre las causas y consecuencias de la enfermedad periodontal así como sobre técnicas preventivas, incluyendo la técnica de cepillado sulcular y uso de hilo dental. Las personas recibirán cepillos suaves junto con una pasta dental con fluoruro, que se repondrá según sea necesario. Se realizará una eliminación profesional de biofilm y cálculo supragingival, así como factores de retención de biofilm, si es necesario.

   Tratamiento: Raspado y alisado radicular de todos los dientes que presenten indicación. Luego de la fase activa del tratamiento, los pacientes serán incluidos en terapia de soporte con controles quincenales en el primer mes y mensuales, hasta el final del estudio, que contengan orientación higiénica, profilaxis y retratamiento trimestral de dientes que tengan profundidad de sondaje mayor a 5 mm, con BoP.

6. Fase quirúrgica

   Los dientes que presenten una profundidad de sondaje residual ≥ 6 mm asociada con evidencia radiográfica de defectos intraboby, de acuerdo con los criterios de inclusión mencionados anteriormente, serán incluidos en el procedimiento quirúrgico. Los procedimientos regenerativos solo se programarán cuando todos los procedimientos no quirúrgicos necesarios se realicen junto con niveles adecuados de PI y GI de hasta el 20 %. Todos los procedimientos quirúrgicos serán realizados por el mismo operador. Una hora antes de la terapia, los pacientes recibirán una dosis única de 4 mg de dexametasona.

   Descripción de la técnica: Tras la administración de anestésicos locales, se levantarán colgajos de espesor total para acceder a todas las caras del defecto. Se realizarán incisiones sulculares que se extiendan a los dientes adyacentes mesiales y distales, incluyendo toda la papila en el colgajo. No se realizarán incisiones relajantes. A continuación, se eliminará cuidadosamente todo el tejido de granulación y, posteriormente, se realizará el raspado y alisado radicular. El área quirúrgica se irrigará con solución salina al 0,9% y se inspeccionará cuidadosamente para garantizar que todos los pasos se hayan realizado satisfactoriamente hasta ese momento. Después de esta fase inicial del procedimiento quirúrgico, se aleatorizarán los defectos. Para los grupos GAP + OFD/EMD y GCP + OFD/EMD, existirá la aplicación de EMD en el defecto. Para ello, la superficie en cuestión debe estar libre de saliva y sangre. Esta sustancia se aplicará inmediatamente a la superficie radicular expuesta. La aplicación se iniciará en la porción más apical del nivel óseo hasta la cobertura total del defecto y la superficie radicular. Luego se reposicionarán los colgajos y se suturarán pasivamente hasta el cierre primario de los tejidos.

   Cuidados postoperatorios: Se indicará a los pacientes que tomen analgésicos (dipirona sódica 500 mg cada 4 horas durante 2 días) y quelantes de digluconato de clorhexidina al 0,12 % (2 veces al día durante 15 días). Las suturas se retirarán a los 15 días de la intervención quirúrgica. Durante el postoperatorio se le pedirá al paciente que deje de cepillarse los dientes y usar hilo dental en el área de la intervención durante 15 días, momento en el que retomará los hábitos de higiene bucal.

7. Evaluación clinica

   La precalibración del examinador para las mediciones se realizará para asegurar la fiabilidad de los datos obtenidos a través de dos exámenes, con un intervalo máximo de 48 horas entre ellos, en 8 pacientes distintos no investigados. El índice Kappa y la correlación intraclase se utilizarán para evaluar la reproducibilidad y la concordancia.

   Todos los parámetros clínicos se obtendrán utilizando una sonda periodontal tipo Carolina del Norte, al inicio del estudio, 3, 6 meses y 1 año después, con la ayuda de stents/guías acrílicas individuales, hechas a partir de modelos de estudio preformados por el examinador.

   Los parámetros clínicos evaluados serán: Índice de placa - PI; Sangrado al sondaje - BoP; Posición del margen gingival - GMP: distancia del stent al margen gingival libre; Nivel Relativo de Inserción Clínica - rCAL: distancia desde el stent hasta la base clínicamente detectable de la bolsa periodontal; Profundidad de sondaje - PD (rCAL - GMP): distancia desde el margen gingival hasta la base clínicamente detectable de la bolsa periodontal.

   En el momento transquirúrgico se realizarán las siguientes mediciones: Distancia entre el margen del stent y la cresta ósea alveolar (BC-ST); Distancia entre la cresta ósea alveolar y la base del defecto (BC-BD), que caracteriza el componente vertical del defecto intraóseo; Distancia desde la cresta ósea alveolar hasta la superficie radicular (BC-RS), caracterizando el componente horizontal del defecto.

8. Satisfacción del paciente y percepción de la terapia

   Para la valoración de la percepción del paciente sobre el procedimiento realizado y el postoperatorio, recibirá un cuestionario a los 15 días del procedimiento. El grado de malestar y/o dolor experimentado durante el período transoperatorio se evaluará utilizando una escala visual analógica (EVA) horizontal de 100 mm, que va desde la ausencia hasta el extremo. También se indicará a los pacientes que cuantifiquen la cantidad de analgésico utilizado. Además, se valorará de la misma forma la extensión de las molestias, la hipersensibilidad radicular, el edema, el hematoma, la fiebre y la interferencia con las actividades diarias durante la primera semana del postoperatorio. A los 6 meses del procedimiento quirúrgico, se entregará otro cuestionario para determinar la percepción de los individuos sobre los resultados y el nivel de satisfacción con el tratamiento. El cuestionario utilizará una escala simplificada para registrar la satisfacción con el tratamiento en términos de apariencia estética del diente tratado seleccionando uno de los siguientes: Muy satisfecho, neutral, moderadamente satisfecho o insatisfecho. Además, se interrogará a los pacientes sobre sus percepciones respecto a los resultados de la terapia aplicada a los dientes en cuestión, en cuanto a mejoría del sangrado gingival, enrojecimiento, edema y patrón de higiene. Estos parámetros también serán evaluados a través de la escala EVA, siendo 0 ninguna mejoría y 100 la máxima mejoría. También se utilizará el Perfil de Impacto en la Salud Bucal-14 (OHIP-14) para tener acceso a la calidad de vida relacionada con la salud bucal, aplicado en el preoperatorio y 6 meses después. Las dimensiones del impacto son: limitación funcional, dolor físico, malestar psicológico, incapacidad física, incapacidad psicológica e incapacidad para realizar las actividades de la vida diaria. También se aplicará una adaptación del Cuestionario de Satisfacción del Paciente Post-Quirúrgico (PSPSQ) para evaluar la satisfacción del paciente con el procedimiento quirúrgico en el postoperatorio de 15 días y 6 meses. Esta escala de 3 ítems, con respuesta de 0 a 10 (0 = no en 10 = totalmente), es capaz de evaluar la satisfacción del paciente a corto y largo plazo en el postoperatorio.

9. Evaluación radiográfica[

   Las radiografías periapicales de todos los defectos intraóseos se realizarán al inicio, después de 6 meses y 1 año, utilizando la técnica de paralelismo, por el mismo examinador. Para la estandarización de las imágenes se realizarán registros oclusales en resina acrílica químicamente activada con posicionadores radiográficos. Se colocará un alambre de ortodoncia estándar de tamaño conocido sobre el soporte oclusal en una posición específica, y se obtendrá la imagen de este alambre en radiografías para la corrección de la angulación vertical y horizontal durante los análisis.

   Las radiografías se realizarán mediante un sistema digital que utiliza placas de almacenamiento de fósforo flexibles y reutilizables (PSP; 31 mm x 41 mm). La selección del tiempo de exposición ocurrirá de acuerdo al diente relacionado con el defecto, ya que el aparato a ser utilizado (Rayos X Sommo de columna móvil, tubo: 70 kV, 7 mA, distancia focal: 20 cm, especificaciones: 800- 1200 VA, 50-60 Hz, cuenta con un sistema de selección de dientes semiautomático, con tiempos de exposición establecidos que van de 0,32 a 0,40 segundos. Para la lectura de las imágenes se utilizará un escáner específico. Las imágenes obtenidas serán luego almacenadas en una computadora hasta el momento del análisis. La resolución por defecto será 96x96 dpi y 32 bit. Todas las imágenes se grabarán en formato TIFF (.tif). Las medidas radiográficas de los defectos se realizarán mediante un software específico para el análisis de imágenes. Los ángulos radiográficos de los defectos se evaluarán y definirán mediante dos líneas que representan la superficie de la raíz y la superficie del defecto óseo.

   Se medirán los siguientes parámetros radiográficos lineales: distancia de la unión cemento-esmalte (CEJ) a la base del defecto (BD) (CEJ-BD); Distancia desde la UCE y la porción más coronal de la cresta ósea alveolar (BC) (CEJ-BC); Distancia entre BD y BC (BD-BC). Las diferencias entre los valores encontrados a los 6 meses y 1 año después de la operación y la línea de base para CEJ-BD indicarán la cantidad de relleno de tejido duro del defecto infraóseo. Las diferencias entre CEJ-BC y BD-BC identificarán la cantidad de reabsorción de la cresta ósea y la profundidad del defecto intraóseo, respectivamente.

10. Evaluación microbiológica

    La evaluación microbiológica se realizará mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del tipo tiempo real. Esta prueba permitirá la detección cuantitativa de las siguientes bacterias: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro y P. intermedia.

    Las muestras de biopelícula subgingival se realizarán al inicio del estudio, 3, 6 meses y 1 año después del procedimiento quirúrgico, por el mismo examinador. Para ello se utilizarán los dientes y caras previamente seleccionados para la fase quirúrgica. Se aislará debidamente la zona con rollos de algodón esterilizados. Se eliminará la porción supragingival de la biopelícula y luego se obtendrán muestras de la biopelícula subgingival colocando conos de papel absorbente estéril dentro de la bolsa. Transcurridos 30 segundos se retirarán los conos de papel y se colocarán en microtubos de centrífuga con solución Tris-EDTA, codificados para cada paciente. Los eppendorfs se mantendrán a -20 °C hasta que se realice el ensayo.

    Para la extracción de ADN, los microtubos se agitarán y los conos de papel se retirarán con una pinza clínica. Las muestras se centrifugarán para eliminar el sobrenadante. Se agregan 700 μL de tampón de extracción, se agita nuevamente y se colocan en un baño de agua durante 30 minutos a 65 °C. El siguiente paso será agregar 650 μl de CIA, homogeneizar hasta obtener una emulsión (20 veces) y centrifugar a 12 000-15 000 rpm durante 7 minutos La fase acuosa se transferirá a un nuevo microtubo de 1,5 mL, al que se le añadirán 200 µL de tampón de extracción sin proteinasa K. A continuación, se realizará la homogeneización para la adición de 650 µl de CIA. Se prosigue la homogeneización y centrifugación a 12.000-15.000 rpm durante 7 minutos. La fase acuosa se transferirá a un tubo nuevo, al que se le agregarán 650 μl de CIA, seguido de una centrifugación a 12.000-15.000 rpm durante 7 minutos (repetir dos veces más si es necesario). El ADN se precipitará con 1 volumen de isopropanol a temperatura ambiente, luego se homogeneizará (20 veces) y se centrifugará a 12.000-15.000 rpm durante 7 minutos. La superficie del precipitado se lavará una vez con 50 μl de etanol al 70% preparado poco antes de su uso y luego se centrifugará durante 2 minutos. Se debe secar el precipitado, dejando el tubo abierto en banco al lado de la boquilla de Busen. Posteriormente se hará la resuspensión en 40 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0) + 10 μg/mL RNAsa y dejar en baño maría a 37°C por 30 minutos. Se utilizarán cinco μL de la muestra para comprobar la calidad y estimar la cantidad de ADN en un 0,8-1,0% Gel de agarosa. Un estándar de masa conocido (pGEM) se ejecutará en conjunto.

    PCR en tiempo real DIBUJO DE PRIMERS: Se utilizarán primers específicos para Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia y A. actinomycetemcomitans. Se comprobará la especificidad de todos los cebadores mediante la comprobación de la curva de fusión (obtenida después de ejecutar en el LightCycler) y el gel de ejecución para la verificación del producto.

    OPTIMIZACIÓN DE LAS REACCIONES: El uso de SYBR Green I requiere productos de PCR específicos, de modo que la eficacia de las reacciones de los cebadores se optimice antes del inicio de las propias reacciones. Se utilizarán concentraciones que oscilan entre 2 y 5 mM de MgCl2 y entre 0,2 y 0,5 μM de cada cebador para determinar en qué condiciones la reacción tendría la mayor eficiencia. Condiciones sugeridas por el fabricante del equipo.

    Reacciones de RT-PCR: Las reacciones de RT-PCR se realizarán con el sistema LightCycler utilizando el kit FastStart DNA Master SYBR Green I. El perfil de reacción se determinará siguiendo las recomendaciones del fabricante del equipo. Para cada una de las "corridas", el agua se utilizará como control negativo y el producto de reacción se cuantificará utilizando el programa propio del fabricante.

11. Test inmunoenzimático (plataforma Luminex / MAGpix)

    Las recolecciones de fluido crevicular gingival (GCF) se realizarán al inicio, 15, 45 días, 3, 6 meses y 1 año después del estudio, por el mismo examinador. Para ello se utilizarán los dientes y caras previamente seleccionados para la fase quirúrgica. Durante la recogida del material, se aislará debidamente el sitio afectado y se secará con rollos de algodón esterilizados. La porción supragingival de la biopelícula bacteriana se eliminará para obtener muestras de GCF colocando tiras de papel dentro de la interfase diente/tejido periodontal durante 30 segundos. Se utilizarán dos tiras de papel por sitio para la obtención del adecuado y luego se colocarán las tiras de papel en tubos de microcentrífuga, codificados para cada individuo y períodos experimentales con 150 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Tween-20 al 0,05%. Las muestras se almacenarán para su posterior análisis.

    Antes del análisis, las muestras de fluidos se diluirán en 60 μl de tampón del kit Millipore, se agitarán durante 30 minutos y luego se centrifugarán durante 10 minutos a 10 000 rpm. Se analizarán alícuotas de cada muestra de GCF para la detección de marcadores óseos (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH y RANKL) mediante tecnología Luminex/MAGpix. Para ello, los análisis se realizarán en placas de 96 pocillos con la ayuda de paneles de alta sensibilidad, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los pocillos se lavarán con tampón de lavado y se aspirarán. Se agregarán a los pocillos microesferas exclusivas conjugadas con anticuerpos monoclonales contra los diferentes analitos a analizar (las microesferas de poliestireno se tiñen con proporciones precisas de dos fluoróforos, creando un "código de color" para su posterior identificación por parte del instrumento Luminex/MAGpix). Las muestras y los reactivos para la curva estándar se pipetearán en los pocillos y se incubarán durante la noche a 4oC. A continuación, se lavarán los pocillos y se añadirá una mezcla de anticuerpos secundarios. Después de 1 hora de incubación, la detección final se realizará a través de una tercera etiqueta fluorescente, Estreptavidina-Ficoeritrina (PE) unida al anticuerpo de detección. El equipo Luminex/MAGpix moverá estas perlas en fila india a través de haces de dos láseres diferentes en un citómetro de flujo. El primer rayo láser detectará (clasificará) la microesfera (el código de color para la prueba) y el segundo láser cuantificará la señal de informe en cada microesfera. Las muestras se analizarán individualmente y sus concentraciones se estimarán a partir de una curva estándar utilizando una ecuación polinomial utilizando el software Xponent. Las concentraciones medias de cada marcador se expresarán en pg/μl. Las muestras con cuantificación por debajo del límite de detección del análisis se registrarán como "cero" y las muestras por encima del límite de cuantificación de la curva estándar se registrarán igual al valor más alto de la curva.

12. Análisis de resultados El análisis de los resultados se realizará mediante estadística descriptiva utilizando tablas y gráficos que contengan frecuencias absolutas y relativas y parámetros de media y desviación estándar. La comparación de las variables cuantitativas se realizará mediante análisis de varianza y prueba de Tukey. Las variables cualitativas se compararán mediante la prueba de chi-cuadrado. La comprobación de la correlación entre las variables se realizará mediante el coeficiente de correlación de Pearson y Spearman. En todas las pruebas se adoptará un nivel de significancia del 5%.