Schmelzmatrixproteine ​​bei der Behandlung von intraossären Defekten bei Patienten mit aggressiver und chronischer Parodontitis

Allgemeiner Arbeitsplan und experimentelle Methodik

1. Stichprobenauswahl

   Nach Einreichung und Genehmigung dieses Projekts beim Research Ethics Committee (CEP) der Piracicaba Dental School - UNICAMP wird es unter den Patienten ausgewählt, die spontan eine Behandlung in Kliniken nach Abschluss des FOP-UNICAMP suchen (wo auch die klinische Phase durchgeführt wird von der Studie), 45 Patienten gemäß den Einschlusskriterien

2. Stichprobenkalkül

   Die für jede Gruppe erforderliche Stichprobengröße wurde unter Berücksichtigung des Clinical Attachment Level (CAL) als primäre Variable berechnet. Um einen Unterschied von 1 mm mit 5 % Alpha zwischen den Gruppen zu erkennen, sind unter Berücksichtigung einer Standardabweichung von 1 mm Fehler und 80 % Testleistung mindestens 12 Patienten in jeder Gruppe erforderlich. In Anbetracht dessen, dass einige Patienten während der Nachsorge verloren gehen können, werden 15 Patienten in die vorliegende Studie aufgenommen.

3. Randomisierung und Verblindung

   Der Untersucher ist für die Behandlungen blind. Dies wird erreicht, indem festgelegt wird, dass die Beurteilungen von einem Fachmann vorgenommen werden, der nicht an der Behandlung beteiligt ist. Die Einteilung der Patienten in eine Gruppe sollte per Los erfolgen, um eine vollständige Zufallsstichprobe zu sein, wobei die Behandlungen nach dem Zufallsprinzip auf die Patienten verteilt werden. Zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs werden braune Umschläge verwendet, die Informationen der Behandlungsgruppe enthalten, die von einem Computersystem generiert wurden.

4. Studiendesign

   Eine parallele Studie wird an 45 Patienten mit einer Dauer von einem Jahr durchgeführt. Die ausgewählten Patienten werden wie folgt in 3 Gruppen eingeteilt, deren Zähne die vorgeschlagenen Behandlungen erhalten:

   • Gruppe GAP Chirurgischer Zugang (GAP + OFD, 15 Patienten) – Patienten mit diagnostizierter generalisierter aggressiver Parodontitis (PAG), bei denen der zuvor ausgewählte intraossäre Defekt erhalten wird, erhalten ein Debridement mit offenem Lappen.
   • Gruppe GAP Chirurgischer Zugang + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 Patienten) – Patienten mit der Diagnose einer generalisierten aggressiven Parodontitis (PAG), bei denen der zuvor ausgewählte intraossäre Defekt ein Débridement mit offenem Lappen und zusätzlich die Anwendung der EMD erhält im Defekt.
   • Gruppe GCP Chirurgischer Zugang + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 Patienten) - Patienten mit der Diagnose einer generalisierten chronischen Parodontitis (PCG), bei denen der zuvor ausgewählte intraossäre Defekt ein Debridement mit offenem Lappen und zusätzlich die Anwendung der EMD erhält im Defekt.

5. Präoperative Phase

   Eingangsuntersuchung: Auswahl der Patienten nach vorher festgelegten Kriterien.

   Anfangstherapie: Alle Patienten werden über die Ursachen und Folgen der Parodontitis sowie über vorbeugende Techniken aufgeklärt, einschließlich der Technik des Sulkusbürstens und der Verwendung von Zahnseide. Einzelpersonen erhalten weiche Bürsten in Verbindung mit einer fluoridhaltigen Zahnpasta, die bei Bedarf aufgefüllt wird. Es wird eine professionelle Entfernung von Biofilm und supragingivalem Zahnstein sowie bei Bedarf Biofilm-Retentionsfaktoren durchgeführt.

   Behandlung: Scaling und Wurzelglättung aller indizierten Zähne. Nach der aktiven Phase der Behandlung werden die Patienten in eine unterstützende Therapie mit zweiwöchentlichen Kontrollen im ersten Monat und monatlich bis zum Ende der Studie aufgenommen, die Hygieneorientierung, Prophylaxe und vierteljährliche Nachbehandlung von Zähnen enthalten, die eine Sondierungstiefe von mehr als aufweisen 5 mm, mit BoP.

6. Chirurgische Phase

   Zähne, die eine verbleibende Sondierungstiefe von ≥ 6 mm aufweisen, verbunden mit röntgenologischen Nachweisen von Intrahoby-Defekten, gemäß den oben genannten Einschlusskriterien, werden in das chirurgische Verfahren eingeschlossen. Regenerative Eingriffe werden nur geplant, wenn alle erforderlichen nicht-chirurgischen Eingriffe gleichzeitig mit angemessenen PI- und GI-Werten von bis zu 20 % durchgeführt werden. Alle chirurgischen Eingriffe werden von demselben Operateur durchgeführt. Eine Stunde vor der Therapie erhalten die Patienten eine Einzeldosis Dexamethason 4 mg.

   Beschreibung der Technik: Nach Verabreichung von Lokalanästhetika werden Vollhautlappen angehoben, um alle Defektflächen zu erreichen. Es werden Sulkularinzisionen durchgeführt, die sich bis zu den mesialen und distalen Nachbarzähnen erstrecken, einschließlich der gesamten Papille im Lappen. Es werden keine Entspannungsschnitte durchgeführt. Anschließend wird alles Granulationsgewebe sorgfältig entfernt und anschließend ein Scaling und eine Wurzelglättung durchgeführt. Das Operationsgebiet wird mit 0,9 %iger Kochsalzlösung gespült und sorgfältig inspiziert, um sicherzustellen, dass alle Schritte bis dahin zufriedenstellend durchgeführt wurden. Nach dieser Anfangsphase des chirurgischen Eingriffs werden die Defekte randomisiert. Für die Gruppen GAP + OFD/EMD und GCP + OFD/EMD erfolgt die Anwendung von EMD im Defekt. Dazu sollte die betreffende Oberfläche speichel- und blutfrei sein. Diese Substanz wird sofort auf die freigelegte Wurzeloberfläche aufgetragen. Die Anwendung beginnt am apikalsten Teil des Knochenniveaus bis zur vollständigen Abdeckung des Defekts und der Wurzeloberfläche. Die Lappen werden dann repositioniert und bis zum primären Gewebeverschluss passiv vernäht.

   Postoperative Versorgung: Die Patienten werden angewiesen, ein Analgetikum (Natriumdipyron 500 mg alle 4 Stunden für 2 Tage) und 0,12 % Chlorhexidindigluconat (2 mal täglich für 15 Tage) zu chelatieren. Die Nähte werden 15 Tage nach dem chirurgischen Eingriff entfernt. Während der postoperativen Phase wird der Patient gebeten, das Bürsten und die Verwendung von Zahnseide im Eingriffsbereich für 15 Tage einzustellen, wenn die Mundhygienegewohnheiten wieder aufgenommen werden.

7. Klinische Bewertung

   Die Vorkalibrierung des Untersuchers für die Messungen wird durchgeführt, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten, die durch zwei Untersuchungen mit einem maximalen Abstand von 48 Stunden zwischen ihnen bei 8 verschiedenen Nicht-Forschungspatienten erhalten wurden. Der Kappa-Index und die Intraklassenkorrelation werden verwendet, um die Reproduzierbarkeit und Übereinstimmung zu bewerten.

   Alle klinischen Parameter werden mit einer parodontalen Sonde vom Typ North Carolina zu Studienbeginn, 3, 6 Monaten und 1 Jahr danach mit Hilfe von Stents/individuellen Acrylführungen, die vom Untersucher aus vorgeformten Studienmodellen hergestellt werden, erhalten.

   Die ausgewerteten klinischen Parameter sind: Plattenindex – PI; Bluten beim Sondieren – BoP; Gingivarandposition - GMP: Abstand vom Stent zum freien Gingivarand; Relative Clinical Attachement Level – rCAL: Abstand vom Stent zur klinisch nachweisbaren Basis der parodontalen Tasche; Sondierungstiefe – PD (rCAL – GMP): Abstand vom Gingivarand bis zur klinisch nachweisbaren Basis der Parodontaltasche.

   Zum transoperativen Zeitpunkt werden folgende Messungen durchgeführt: Abstand zwischen Stentrand und Alveolarknochenkamm (BC-ST); Abstand zwischen dem Alveolarknochenkamm und der Defektbasis (BC-BD), der die vertikale Komponente des intraossären Defekts charakterisiert; Abstand vom Alveolarknochenkamm zur Wurzeloberfläche (BC-RS), der die horizontale Komponente des Defekts charakterisiert.

8. Patientenzufriedenheit und Wahrnehmung der Therapie

   Zur Beurteilung der Wahrnehmung des Patienten bezüglich des durchgeführten Eingriffs und der postoperativen Zeit erhalten sie 15 Tage nach dem Eingriff einen Fragebogen. Das Ausmaß der Beschwerden und/oder Schmerzen, die während der transoperativen Phase auftreten, wird anhand einer 100-mm-horizontalen analogen visuellen Skala (VAS) bewertet, die von Abwesenheit bis extrem reicht. Die Patienten werden auch angewiesen, die Menge des verwendeten Analgetikums zu quantifizieren. Darüber hinaus wird das Ausmaß von Beschwerden, radikulärer Überempfindlichkeit, Ödemen, Hämatomen, Fieber und Beeinträchtigung der täglichen Aktivitäten während der ersten postoperativen Woche auf die gleiche Weise bewertet. Nach 6 Monaten des chirurgischen Eingriffs wird ein weiterer Fragebogen zugestellt, um die Wahrnehmung der Personen hinsichtlich der Ergebnisse und den Grad der Zufriedenheit mit der Behandlung zu ermitteln. Der Fragebogen verwendet eine vereinfachte Skala, um die Behandlungszufriedenheit in Bezug auf das ästhetische Erscheinungsbild des behandelten Zahns zu erfassen, indem eine der folgenden Optionen ausgewählt wird: Sehr zufrieden, neutral, mäßig zufrieden oder unzufrieden. Darüber hinaus werden die Patienten nach ihrer Wahrnehmung bezüglich der Ergebnisse der an den betreffenden Zähnen angewendeten Therapie in Bezug auf die Verbesserung von Zahnfleischbluten, Rötungen, Ödemen und des Hygienemusters befragt. Diese Parameter werden auch anhand der VAS-Skala bewertet, wobei 0 keine Verbesserung und 100 die maximale Verbesserung bedeutet. Das Oral Health Impact Profile-14 (OHIP-14) wird ebenfalls verwendet, um Zugang zur mundgesundheitsbezogenen Lebensqualität zu erhalten, das vor der Operation und 6 Monate später angewendet wird. Die Dimensionen der Auswirkungen sind: Funktionseinschränkung, körperliche Schmerzen, psychische Beschwerden, körperliche Unfähigkeit, psychische Unfähigkeit und Unfähigkeit, alltägliche Aktivitäten auszuführen. Eine Anpassung des Post-Surgical Patient Satisfaction Questionnaire (PSPSQ) wird auch angewendet, um die Zufriedenheit des Patienten mit dem chirurgischen Eingriff in der postoperativen Phase von 15 Tagen und 6 Monaten zu bewerten. Diese 3-Punkte-Skala mit einer Antwort von 0 bis 10 (0 = nicht bei 10 = voll und ganz) ist in der Lage, die kurz- und langfristige Zufriedenheit des Patienten in der postoperativen Phase zu bewerten.

9. Röntgenuntersuchung[

   Periapikale Röntgenaufnahmen aller intraossären Defekte werden an der Basislinie nach 6 Monaten und 1 Jahr unter Verwendung der Paralleltechnik vom selben Untersucher durchgeführt. Zur Standardisierung der Bilder werden okklusale Aufnahmen in chemisch aktiviertem Acrylharz mit Röntgenpositionierern gemacht. Ein kieferorthopädischer Standarddraht bekannter Größe wird an einer bestimmten Position auf der okklusalen Stütze platziert, und das Bild dieses Drahts wird auf Röntgenbildern zur Korrektur der vertikalen und horizontalen Angulation während der Analysen erhalten.

   Die Röntgenaufnahmen werden von einem digitalen System mit flexiblen und wiederverwendbaren Phosphorspeicherplatten (PSP; 31 mm x 41 mm) durchgeführt. Die Auswahl der Belichtungszeit erfolgt je nach defektem Zahn, da die zu verwendende Apparatur (Sommo-Röntgen-Mobilsäule, Röhre: 70 kV, 7 mA, Brennweite: 20 cm, Spezifikationen: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; verfügt über ein halbautomatisches Zahnauswahlsystem mit etablierten Belichtungszeiten von 0,32 bis 0,40 Sekunden. Zum Lesen der Bilder wird ein spezieller Scanner verwendet. Die erhaltenen Bilder werden dann bis zur Analyse in einem Computer gespeichert. Die Standardauflösung beträgt 96 x 96 dpi und 32 Bit. Alle Bilder werden im TIFF-Format (.tif) aufgezeichnet. Röntgenmessungen von Defekten werden mit einer speziellen Software zur Bildanalyse durchgeführt. Die Röntgenwinkel der Defekte werden bewertet und durch zwei Linien definiert, die die Wurzeloberfläche und die Oberfläche des Knochendefekts darstellen.

   Die folgenden linearen Röntgenparameter werden gemessen: Abstand der Zement-Schmelz-Grenze (CEJ) zur Defektbasis (BD) (CEJ-BD); Abstand vom CEJ und dem stärker koronalen Teil des Alveolarknochenkamms (BC) (CEJ-BC); Entfernung zwischen BD und BC (BD-BC). Unterschiede zwischen den Werten, die 6 Monate und 1 Jahr postoperativ gefunden wurden, und dem Ausgangswert für CEJ-BD zeigen das Ausmaß der Hartgewebsfüllung des infraossären Defekts an. Unterschiede zwischen CEJ-BC und BD-BC zeigen das Ausmaß der Resorption des Knochenkamms bzw. die Tiefe des intraossären Defekts

10. Mikrobiologische Bewertung

    Die mikrobiologische Bewertung erfolgt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vom Real-Time-Typ. Dieser Test ermöglicht den quantitativen Nachweis der folgenden Bakterien: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro und P. intermedia.

    Subgingivale Biofilmproben werden zu Beginn, 3, 6 Monate und 1 Jahr nach dem chirurgischen Eingriff vom selben Untersucher durchgeführt. Dazu werden die zuvor für die chirurgische Phase ausgewählten Zähne und Flächen verwendet. Der Bereich wird ordnungsgemäß mit sterilisierten Watterollen isoliert. Der supragingivale Teil des Biofilms wird entfernt, und dann werden Proben des subgingivalen Biofilms entnommen, indem sterile absorbierende Papierkegel in die Tasche gelegt werden. Nach 30 Sekunden werden die Papierkegel entfernt und in Mikrozentrifugenröhrchen mit Tris-EDTA-Lösung gegeben, die für jeden Patienten codiert sind. Die Eppendorfs werden bei -20 °C gehalten, bis der Test durchgeführt wird.

    Für die DNA-Extraktion werden die Mikroröhrchen gevortext und die Papierkegel mit einer klinischen Klemmhilfe entfernt. Die Proben werden zur Entfernung des Überstands zentrifugiert. 700 µL Extraktionspuffer werden zugegeben, weiter geschüttelt und für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 65 °C gestellt. Als nächster Schritt werden 650 µl CIA zugegeben, zu einer Emulsion homogenisiert (20 mal) und bei 12.000–15.000 U/min zentrifugiert 7 Minuten. Die wässrige Phase wird in ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen überführt, dem 200 µl Extraktionspuffer ohne Proteinase K zugesetzt werden. Anschließend erfolgt eine Homogenisierung zur Zugabe von 650 µl CIA. Eine weitere Homogenisierung und Zentrifugation bei 12.000–15.000 U/min wird für 7 Minuten fortgesetzt. Die wässrige Phase wird in ein neues Röhrchen überführt, dem 650 μl CIA zugesetzt werden, gefolgt von einer 7-minütigen Zentrifugation bei 12.000–15.000 U/min (bei Bedarf zwei weitere Male wiederholen). Die DNA wird mit 1 Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur präzipitiert, dann homogenisiert (20 Mal) und bei 12.000–15.000 U/min für 7 Minuten zentrifugiert. Die Oberfläche des Präzipitats wird einmal mit 50 μl 70 %igem Ethanol gewaschen, das kurz vor der Verwendung hergestellt wurde, und dann für 2 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag sollte getrocknet werden, wobei das Röhrchen offen auf der Bank neben der Düse von Busen gelassen wird. Anschließend erfolgt eine Resuspendierung in 40 µL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) + 10 µg/mL RNAse und 30 Minuten im Wasserbad bei 37 °C zu belassen. Fünf μL der Probe werden verwendet, um die Qualität zu überprüfen und die DNA-Menge in einem 0,8-1,0% Agarose-Gel. Ein bekannter Massenstandard (pGEM) läuft zusammen.

    Real-Time-PCR-ZEICHNUNG VON PRIMERN: Spezifische Primer für Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia und A. actinomycetemcomitans werden verwendet. Alle Primer werden auf Spezifität überprüft, indem die Schmelzkurve (erhalten nach dem Laufen im LightCycler) und das Laufgel zur Produktüberprüfung überprüft werden.

    OPTIMIERUNG DER REAKTIONEN: Die Verwendung von SYBR Green I erfordert spezielle PCR-Produkte, damit die Wirksamkeit der Primerreaktionen vor der Initiierung der Reaktionen selbst optimiert wird. Konzentrationen im Bereich von 2 bis 5 mM MgCl2 und von 0,2 bis 0,5 μM jedes Primers werden verwendet, um zu bestimmen, unter welchen Bedingungen die Reaktion die beste Effizienz aufweisen würde. Vom Gerätehersteller vorgeschlagene Bedingungen.

    RT-PCR-Reaktionen: RT-PCR-Reaktionen werden mit dem LightCycler-System unter Verwendung des FastStart DNA Master SYBR Green I-Kits durchgeführt. Das Reaktionsprofil wird gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers bestimmt. Für jeden der "Läufe" wird das Wasser als Negativkontrolle verwendet und das Reaktionsprodukt wird unter Verwendung des eigenen Programms des Herstellers quantifiziert.

11. Immunenzymatischer Test (Luminex-Plattform / MAGpix)

    Gingival Crevicular Fluid (GCF)-Sammlungen werden zu Studienbeginn, 15, 45 Tage, 3, 6 Monate und 1 Jahr nach der Studie vom selben Untersucher durchgeführt. Dazu werden die zuvor für die chirurgische Phase ausgewählten Zähne und Flächen verwendet. Während der Materialsammlung wird die betroffene Stelle ordnungsgemäß isoliert und mit sterilisierten Watterollen getrocknet. Der supragingivale Teil des bakteriellen Biofilms wird entfernt, um GCF-Proben zu erhalten, indem Papierstreifen 30 Sekunden lang in der Grenzfläche zwischen Zahn und parodontalem Gewebe platziert werden. Zwei Papierstreifen pro Standort werden verwendet, um geeignete Proben zu erhalten, und die Papierstreifen werden dann in Mikrozentrifugenröhrchen gelegt, die für jeden einzelnen und experimentellen Zeitraum mit 150 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 0,05 % Tween-20 kodiert werden. Die Proben werden für weitere Analysen aufbewahrt.

    Vor der Analyse werden die Flüssigkeitsproben in 60 μl Puffer aus dem Millipore-Kit verdünnt, 30 Minuten gevortext und dann 10 Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert. Aliquots jeder GCF-Probe werden zum Nachweis von Knochenmarkern (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH und RANKL) mit der Luminex/MAGpix-Technologie analysiert. Dazu werden die Analysen in 96-Well-Platten mit Hilfe von High-Sensitivity-Panels nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Vertiefungen werden kurz mit Waschpuffer gewaschen und abgesaugt. Exklusive Mikrokügelchen, die mit monoklonalen Antikörpern gegen die verschiedenen zu analysierenden Analyten konjugiert sind, werden in die Vertiefungen gegeben (die Polystyrol-Mikrokügelchen werden mit genauen Anteilen von zwei Fluorophoren gefärbt, wodurch ein „Farbcode“ zur weiteren Identifizierung durch das Luminex / MAGpix-Instrument entsteht). Proben und Reagenzien für die Standardkurve werden in die Wells pipettiert und über Nacht bei 4oC inkubiert. Die Vertiefungen werden dann gewaschen und eine Mischung sekundärer Antikörper wird hinzugefügt. Nach 1-stündiger Inkubation erfolgt der endgültige Nachweis über eine dritte fluoreszierende Markierung, Streptavidin-Phycoerythrin (PE), die an den Nachweisantikörper gebunden ist. Die Luminex/MAGpix-Ausrüstung bewegt diese Kügelchen in einer einzigen Datei durch Bündel von zwei verschiedenen Lasern auf einem Durchflusszytometer. Der erste Laserstrahl erkennt (klassifiziert) die Mikrosphäre (den Farbcode für den Test) und der zweite Laser quantifiziert das Meldesignal in jeder Mikrosphäre. Die Proben werden einzeln analysiert und ihre Konzentrationen werden aus einer Standardkurve unter Verwendung einer Polynomgleichung unter Verwendung der Xponent-Software geschätzt. Die mittleren Konzentrationen jedes Markers werden in pg/μl ausgedrückt. Proben mit einer Quantifizierung unterhalb der Nachweisgrenze der Analyse werden als "Null" aufgezeichnet und Proben oberhalb der Quantifizierungsgrenze der Standardkurve werden gleich dem höchsten Wert der Kurve aufgezeichnet.

12. Analyse der Ergebnisse Die Analyse der Ergebnisse erfolgt durch deskriptive Statistik unter Verwendung von Tabellen und Grafiken, die absolute und relative Häufigkeiten und Parameter der mittleren und Standardabweichung enthalten. Der Vergleich der quantitativen Variablen erfolgt durch Varianzanalyse und Tukey-Test. Qualitative Variablen werden mit dem Chi-Quadrat-Test verglichen. Die Korrelationsprüfung zwischen den Variablen erfolgt über den Korrelationskoeffizienten von Pearson und Spearman. Bei allen Tests wird ein Signifikanzniveau von 5 % angenommen.