Proteine ​​della matrice dello smalto nel trattamento dei difetti infraossei in pazienti con parodontite cronica e aggressiva

Piano generale di lavoro e metodologia sperimentale

1. Selezione del campione

   Dopo la presentazione e l'approvazione di questo progetto al Comitato Etico di Ricerca (CEP) della Piracicaba Dental School - UNICAMP, saranno selezionati tra i pazienti che cercano spontaneamente un trattamento nelle cliniche pos graduate FOP-UNICAMP (dove verrà eseguita anche la fase clinica di lo studio), 45 pazienti secondo i criteri di inclusione

2. Calcolo del campionamento

   La dimensione del campione richiesta per ciascun gruppo è stata calcolata considerando il livello di attaccamento clinico (CAL) come variabile primaria. Per rilevare una differenza di 1 mm con il 5% di alfa tra i gruppi, considerando una deviazione standard di 1 mm di errore e l'80% della potenza del test, saranno necessari almeno 12 pazienti in ciascun gruppo. Considerando che alcuni pazienti potrebbero essere persi durante il follow-up, 15 pazienti saranno inclusi nel presente studio.

3. Randomizzazione e accecamento

   L'esaminatore sarà cieco ai trattamenti. Ciò si ottiene determinando che le valutazioni siano effettuate da un professionista non coinvolto nel trattamento. La divisione dei pazienti in un gruppo dovrebbe essere fatta a sorte per essere un campione interamente casuale, con i trattamenti distribuiti casualmente tra i pazienti. Verranno utilizzate buste marroni, al momento della procedura chirurgica, contenenti informazioni dal gruppo di trattamento che sono state generate attraverso un sistema computerizzato.

4. Progettazione dello studio

   Verrà condotto uno studio parallelo su 45 pazienti, della durata di un anno. I pazienti selezionati verranno divisi in 3 gruppi, i cui denti riceveranno i trattamenti proposti, come segue:

   • Gruppo GAP Accesso chirurgico (GAP + OFD, 15 pazienti) - I pazienti con diagnosi di parodontite aggressiva generalizzata (PAG), in cui il difetto intraosseo precedentemente selezionato riceverà riceveranno il debridement del lembo aperto.
   • Gruppo GAP Surgical Access + EMD (GAP + OFD/EMD, 15 pazienti) - Pazienti con diagnosi di parodontite aggressiva generalizzata (PAG), in cui il difetto intraosseo precedentemente selezionato riceverà lo sbrigliamento del lembo aperto e, in aggiunta, l'applicazione dell'EMD nel difetto.
   • Gruppo GCP Surgical Access + EMD (GCP + OFD/EMD, 15 pazienti) - Pazienti con diagnosi di parodontite cronica generalizzata (PCG), in cui il difetto intraosseo precedentemente selezionato riceverà lo sbrigliamento del lembo aperto e, in aggiunta, l'applicazione dell'EMD nel difetto.

5. Fase preoperatoria

   Visita iniziale: Selezione dei pazienti secondo criteri prestabiliti.

   Terapia iniziale: tutti i pazienti saranno istruiti sulle cause e le conseguenze della malattia parodontale, nonché sulle tecniche preventive, inclusa la tecnica dello spazzolino sulculare e del filo interdentale. Agli individui verranno forniti spazzolini morbidi insieme a un dentifricio al fluoro, che verrà reintegrato secondo necessità. Verrà eseguita la rimozione professionale del biofilm e del calcolo sopragengivale, nonché i fattori di ritenzione del biofilm, se necessario.

   Trattamento: Detartrasi e levigatura radicolare di tutti i denti che presentano un'indicazione. Dopo la fase attiva del trattamento, i pazienti saranno inclusi in terapia di supporto con controlli bisettimanali nel primo mese e mensili, fino alla fine dello studio, contenenti orientamento all'igiene, profilassi e ritrattamento trimestrale dei denti che hanno una profondità di sondaggio maggiore di 5 mm, con BoP.

6. Fase chirurgica

   I denti che presentano una profondità di sondaggio residua ≥ 6mm associata ad evidenza radiografica di difetti intraboby, secondo i criteri di inclusione sopra menzionati, saranno inclusi nella procedura chirurgica. Le procedure rigenerative saranno programmate solo quando tutte le necessarie procedure non chirurgiche saranno eseguite in concomitanza con adeguati livelli di PI e GI fino al 20%. Tutte le procedure chirurgiche saranno eseguite dallo stesso operatore. Un'ora prima della terapia, i pazienti riceveranno una singola dose di desametasone 4 mg.

   Descrizione della tecnica: Dopo la somministrazione di anestetici locali, verranno sollevati lembi a tutto spessore per accedere a tutte le facce del difetto. Verranno eseguite incisioni sulculari che si estendono ai denti adiacenti mesiali e distali, inclusa l'intera papilla nel lembo. Non verranno eseguite incisioni rilassanti. Tutto il tessuto di granulazione verrà quindi accuratamente rimosso e successivamente verranno eseguiti il ​​ridimensionamento e la levigatura radicolare. L'area chirurgica sarà irrigata con soluzione fisiologica allo 0,9% e attentamente ispezionata per garantire che tutti i passaggi siano stati eseguiti in modo soddisfacente fino a quel momento. Dopo questa fase iniziale della procedura chirurgica, i difetti saranno randomizzati. Per i gruppi GAP + OFD/EMD e GCP + OFD/EMD, ci sarà l'applicazione di EMD nel difetto. Per questo, la superficie in questione dovrebbe essere priva di saliva e sangue. Questa sostanza verrà applicata immediatamente sulla superficie radicolare esposta. L'applicazione inizierà dalla porzione più apicale del livello osseo fino alla totale copertura del difetto e della superficie radicolare. I lembi verranno poi riposizionati e suturati passivamente fino alla chiusura primaria dei tessuti.

   Assistenza postoperatoria: i pazienti verranno istruiti a prendere analgesico (sodio dipirone 500 mg ogni 4 ore per 2 giorni) e chelato clorexidina digluconato allo 0,12% (2 volte al giorno per 15 giorni). Le suture verranno rimosse dopo 15 giorni dall'intervento chirurgico. Durante il periodo postoperatorio, al paziente verrà chiesto di interrompere lo spazzolino e il filo interdentale nell'area della procedura per 15 giorni, quando verranno riprese le abitudini di igiene orale.

7. Valutazione clinica

   La pre-calibrazione dell'esaminatore per le misurazioni verrà eseguita per garantire l'attendibilità dei dati ottenuti attraverso due esami, con un intervallo massimo di 48 ore tra loro, in 8 diversi pazienti non di ricerca. L'indice kappa e la correlazione intraclasse saranno utilizzati per valutare la riproducibilità e l'accordo.

   Tutti i parametri clinici saranno ottenuti utilizzando una sonda parodontale di tipo North Carolina, al basale, 3, 6 mesi e 1 anno successivamente, con l'ausilio di stent/guide acriliche individuali, realizzate da modelli di studio preformati dall'esaminatore.

   I parametri clinici valutati saranno: Plate Index - PI; Sanguinamento al sondaggio - BoP; Posizione del margine gengivale - GMP: distanza dallo stent al margine gengivale libero; Relative Clinical Attachement Leval - rCAL: distanza dallo stent alla base clinicamente rilevabile della tasca parodontale; Profondità di sondaggio - PD (rCAL - GMP): distanza dal margine gengivale alla base clinicamente rilevabile della tasca parodontale.

   Al momento transchirurgico verranno effettuate le seguenti misurazioni: Distanza tra il margine dello stent e la cresta ossea alveolare (BC-ST); Distanza tra la cresta ossea alveolare e la base del difetto (BC-BD), caratterizzante la componente verticale del difetto intraosseo; Distanza dalla cresta ossea alveolare alla superficie radicolare (BC-RS), che caratterizza la componente orizzontale del difetto.

8. Soddisfazione del paziente e percezione della terapia

   Per la valutazione della percezione da parte del paziente della procedura eseguita e del periodo postoperatorio, riceveranno un questionario 15 giorni dopo la procedura. L'entità del disagio e/o del dolore sperimentato durante il periodo transoperatorio sarà valutata utilizzando una scala visiva analogica orizzontale (VAS) di 100 mm, che va dall'assenza all'estremo. I pazienti saranno anche istruiti a quantificare la quantità di analgesico utilizzato. Inoltre, l'entità del disagio, l'ipersensibilità radicolare, l'edema, l'ematoma, la febbre e l'interferenza con le attività quotidiane durante la prima settimana postoperatoria saranno valutate allo stesso modo. Dopo 6 mesi dall'intervento chirurgico, verrà somministrato un altro questionario per determinare la percezione delle persone in merito ai risultati e al livello di soddisfazione del trattamento. Il questionario utilizzerà una scala semplificata per registrare la soddisfazione del trattamento in termini di aspetto estetico del dente trattato selezionando una delle seguenti opzioni: molto soddisfatto, neutrale, moderatamente soddisfatto o insoddisfatto. Inoltre, i pazienti saranno interrogati sulle loro percezioni in merito ai risultati della terapia applicata ai denti in questione, in termini di miglioramento del sanguinamento gengivale, arrossamento, edema e pattern igienico. Questi parametri saranno valutati anche attraverso la scala VAS, dove 0 rappresenta nessun miglioramento e 100 rappresenta il massimo miglioramento. Verrà utilizzato anche l'Oral Health Impact Profile-14 (OHIP-14) per avere accesso alla qualità della vita correlata alla salute orale, applicata prima dell'intervento chirurgico e 6 mesi dopo. Le dimensioni dell'impatto sono: limitazione funzionale, dolore fisico, disagio psicologico, incapacità fisica, incapacità psicologica e disabilità a svolgere le attività quotidiane. Verrà inoltre applicato un adattamento del Post-Surgical Patient Satisfaction Questionnaire (PSPSQ) per valutare la soddisfazione del paziente rispetto alla procedura chirurgica nel periodo postoperatorio di 15 giorni e 6 mesi. Questa scala a 3 item, con una risposta da 0 a 10 (0 = non a 10 = totalmente), è in grado di valutare la soddisfazione a breve ea lungo termine del paziente nel periodo postoperatorio.

9. Valutazione radiografica[

   Le radiografie periapicali di tutti i difetti infraossei saranno eseguite al basale, dopo 6 mesi e 1 anno, utilizzando la tecnica del parallelismo, dallo stesso esaminatore. Per la standardizzazione delle immagini verranno effettuate registrazioni occlusali in resina acrilica attivata chimicamente con posizionatori radiografici. Un filo ortodontico standard di dimensioni note verrà posizionato sul supporto occlusale in una posizione specifica e l'immagine di questo filo sarà ottenuta su radiografie per la correzione dell'angolazione verticale e orizzontale durante le analisi.

   I raggi X saranno eseguiti da un sistema digitale utilizzando lastre di stoccaggio al fosforo flessibili e riutilizzabili (PSP; 31 mm x 41 mm). La scelta del tempo di esposizione avverrà in funzione del dente relativo al difetto, in quanto l'apparecchio da utilizzare (Sommo radiografico su colonna mobile, tubo: 70 kV, 7 mA, lunghezza focale: 20 cm, specifiche: 800- 1200 VA, 50-60 Hz; ha un sistema di selezione dei denti semiautomatico, con tempi di esposizione stabiliti che vanno da 0,32 a 0,40 secondi. Per la lettura delle immagini verrà utilizzato uno scanner specifico. Le immagini ottenute verranno poi archiviate in un computer fino al momento dell'analisi. La risoluzione predefinita sarà 96x96 dpi e 32 bit. Tutte le immagini verranno registrate in formato TIFF (.tif). Le misurazioni radiografiche dei difetti verranno eseguite utilizzando software specifici per l'analisi delle immagini. Gli angoli radiografici dei difetti saranno valutati e definiti da due linee che rappresentano la superficie radicolare e la superficie del difetto osseo.

   Verranno misurati i seguenti parametri radiografici lineari: distanza della giunzione cemento-smalto (CEJ) alla base del difetto (BD) (CEJ-BD); Distanza dalla CEJ e dalla porzione più coronale della cresta ossea alveolare (BC) (CEJ-BC); Distanza tra BD e BC (BD-BC). Le differenze tra i valori riscontrati a 6 mesi e 1 anno dopo l'intervento e il basale per CEJ-BD indicheranno la quantità di riempimento di tessuto duro del difetto infraosseo. Le differenze tra CEJ-BC e BD-BC identificheranno rispettivamente la quantità di riassorbimento della cresta ossea e la profondità del difetto intraosseo

10. Valutazione microbiologica

    La valutazione microbiologica sarà effettuata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) di tipo real time. Questo test consentirà la rilevazione quantitativa dei seguenti batteri: P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. micro e P. intermedia.

    I campioni di biofilm sottogengivale saranno eseguiti al basale, 3, 6 mesi e 1 anno dopo la procedura chirurgica, dallo stesso esaminatore. Per fare ciò verranno utilizzati i denti e le facce precedentemente selezionati per la fase chirurgica. L'area sarà adeguatamente isolata con rotoli di cotone sterilizzati. Verrà rimossa la porzione sopragengivale del biofilm, quindi si otterranno campioni del biofilm sottogengivale posizionando coni di carta assorbente sterile all'interno della tasca. Dopo 30 secondi i coni di carta verranno rimossi e posti in provette da microcentrifuga con soluzione Tris-EDTA, codificata per ogni paziente. Gli eppendorf devono essere mantenuti a -20 °C fino all'esecuzione del test.

    Per l'estrazione del DNA, i microtubi saranno sottoposti a vortex e i coni di carta rimossi con l'ausilio di un morsetto clinico. I campioni saranno centrifugati per la rimozione del supernatante. Si aggiungono 700 µl di tampone di estrazione, si agita ulteriormente e si pone a bagnomaria per 30 minuti a 65 °C. Il passaggio successivo sarà aggiungere 650 µl di CIA, omogeneizzare fino a ottenere un'emulsione (20 volte) e centrifugare a 12.000-15.000 rpm per 7 minuti. La fase acquosa verrà trasferita in una nuova microprovetta da 1.5 mL, a cui verranno aggiunti 200 µL di tampone di estrazione senza proteinasi K. L'omogeneizzazione verrà quindi eseguita per l'aggiunta di 650 µL di CIA. Ulteriore omogeneizzazione e centrifugazione a 12.000-15.000 rpm viene continuata per 7 minuti. La fase acquosa verrà trasferita in una nuova provetta, alla quale verranno aggiunti 650 μl di CIA, seguita da centrifugazione a 12.000-15.000 rpm per 7 minuti (ripetere altre due volte se necessario). Il DNA sarà precipitato con 1 volume di isopropanolo a temperatura ambiente, quindi omogeneizzato (20 volte) e centrifugato a 12.000-15.000 rpm per 7 minuti. La superficie del precipitato sarà lavata una volta con 50 μl di etanolo al 70% preparato poco prima dell'uso e poi centrifugata per 2 minuti. Il precipitato deve essere asciugato, lasciando la provetta aperta sul banco accanto all'ugello di Busen. Successivamente, la risospensione verrà effettuata in 40 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0) + 10 μg / mL RNAse e lasciare a bagnomaria a 37 ° C per 30 minuti. Cinque μL del campione verranno utilizzati per controllare la qualità e stimare la quantità di DNA in uno 0,8-1,0% gel di agarosio. Uno standard di massa noto (pGEM) funzionerà insieme.

    DISEGNO IN PCR REAL TIME DEI PRIMER: Saranno utilizzati primer specifici per Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Parvimonas micra, Prevotella intermedia e A. actinomycetemcomitans. Tutti i primer saranno controllati per la specificità controllando la curva di fusione (ottenuta dopo l'esecuzione nel LightCycler) e l'esecuzione del gel per la verifica del prodotto.

    OTTIMIZZAZIONE DELLE REAZIONI: L'uso di SYBR Green I richiede prodotti PCR specifici, in modo che l'efficacia delle reazioni di primer sia ottimizzata prima dell'inizio delle reazioni stesse. Concentrazioni comprese tra 2 e 5 mM MgCl2 e tra 0.2 e 0.5 μM di ciascun primer saranno utilizzate per determinare in quali condizioni la reazione avrebbe la migliore efficienza. Condizioni suggerite dal produttore dell'apparecchiatura.

    Reazioni RT-PCR: Le reazioni RT-PCR saranno eseguite con il sistema LightCycler utilizzando il kit FastStart DNA Master SYBR Green I. Il profilo di reazione sarà determinato seguendo le raccomandazioni del produttore dell'apparecchiatura. Per ciascuna delle "corse", l'acqua verrà utilizzata come controllo negativo e il prodotto di reazione verrà quantificato utilizzando il programma del produttore.

11. Test immunoenzimatico (piattaforma Luminex / MAGpix)

    Le raccolte di fluido crevicolare gengivale (GCF) saranno eseguite al basale, 15, 45 giorni, 3, 6 mesi e 1 anno dopo lo studio, dallo stesso esaminatore. Per fare ciò verranno utilizzati i denti e le facce precedentemente selezionati per la fase chirurgica. Durante la raccolta del materiale, il sito interessato sarà opportunamente coibentato ed asciugato con rulli di cotone sterilizzati. La porzione sopragengivale del biofilm batterico verrà rimossa per ottenere campioni di GCF posizionando strisce di carta all'interno dell'interfaccia dente/tessuto parodontale per 30 secondi. Verranno utilizzate due strisce di carta per sito per ottenere l'idoneità e le strisce di carta verranno quindi poste in provette da microcentrifuga, codificate per ciascun periodo individuale e sperimentale con 150 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e Tween-20 allo 0,05%. I campioni verranno conservati per ulteriori analisi.

    Prima dell'analisi, i campioni di fluido saranno diluiti in 60μl di tampone del kit Millipore, vortexati per 30 minuti e poi centrifugati per 10 minuti a 10.000 rpm. Aliquote di ciascun campione di GCF saranno analizzate per il rilevamento di marcatori ossei (PDGF, VEGF, FGF, OPG, OCN, OPN, TGFα, PTH e RANKL) mediante tecnologia Luminex / MAGpix. Per fare ciò, le analisi saranno eseguite in piastre da 96 pozzetti con l'ausilio di pannelli ad alta sensibilità, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, i pozzetti saranno lavati con tampone di lavaggio e aspirati. Ai pozzetti verranno aggiunte microsfere esclusive coniugate ad anticorpi monoclonali contro i diversi analiti da analizzare (le microsfere di polistirene vengono colorate con proporzioni precise di due fluorofori, creando un "codice colore" per un'ulteriore identificazione da parte dello strumento Luminex / MAGpix). Campioni e reagenti per la curva standard saranno pipettati nei pozzetti e incubati per una notte a 4°C. I pozzetti verranno quindi lavati e verrà aggiunta una miscela di anticorpi secondari. Dopo un'incubazione di 1 ora, il rilevamento finale sarà effettuato attraverso un terzo marcatore fluorescente, Streptavidina-Ficoeritrina (PE) legato all'anticorpo di rilevamento. L'apparecchiatura Luminex / MAGpix sposterà queste sfere in un unico file attraverso fasci di due diversi laser su un citometro a flusso. Il primo raggio laser rileverà (classificherà) la microsfera (il codice colore per il test) e il secondo laser quantificherà il segnale di segnalazione in ciascuna microsfera. I campioni saranno analizzati individualmente e le loro concentrazioni saranno stimate da una curva standard utilizzando un'equazione polinomiale utilizzando il software Xponent. Le concentrazioni medie di ciascun marcatore saranno espresse in pg/μl. I campioni con quantificazione inferiore al limite di rilevabilità dell'analisi devono essere registrati come "zero" ei campioni al di sopra del limite di quantificazione della curva standard devono essere registrati pari al valore più alto della curva.

12. Analisi dei risultati L'analisi dei risultati sarà effettuata attraverso statistiche descrittive utilizzando tabelle e grafici contenenti frequenze assolute e relative e parametri di media e deviazione standard. Il confronto delle variabili quantitative sarà effettuato mediante analisi della varianza e test di Tukey. Le variabili qualitative saranno confrontate utilizzando il test del chi-quadrato. La verifica della correlazione tra le variabili sarà effettuata tramite il coefficiente di correlazione di Pearson e Spearman. In tutti i test verrà adottato un livello di significatività del 5%.