Hodnocení ProALL miRs ve vzorku krve pro predikci rizika relapsu ALL

Léčba akutní lymfoblastické leukémie založená na riziku:

Děti s ALL jsou obvykle léčeny podle rizikových skupin definovaných jak klinickými, tak laboratorními příznaky. Tento přístup umožňuje dětem se známkami historicky velmi dobrých výsledků, aby byly léčeny mírnou terapií a byly ušetřeny intenzivnější a toxické léčby, zatímco dětem s historicky nižší pravděpodobností dlouhodobého přežití umožňuje dostávat intenzivnější terapii, která může zvýšit ALL. šance pacientů na vyléčení. Studijní skupiny používají různá kritéria, se silným důrazem na měření minimální reziduální nemoci (MRD), která kvantifikují počet leukemických buněk, které zůstávají v pacientovi během a po léčbě. Nejpoužívanější testy MRD jsou založeny na amplifikaci genů pro antigen-receptory polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a na detekci abnormálních imunofenotypů průtokovou cytometrií (Campana, 2010). Tyto techniky identifikují pacientův specifický leukemický klon v kostní dřeni před indukční léčbou a měří počet reziduálních leukemických buněk po indukci. Dva široce používané příklady protokolů rizikové stratifikace jsou protokol Berlín-Frankfurt-Munster (BFM) v Evropě a protokol Skupiny dětské onkologie v USA.

Předchozí zjištění ProALL miR:

MikroRNA (miRNA) prototypového testu ProALL (Avigad et al., 2016) byly objeveny mikročipovou analýzou hybridizací BM aspirátů odebraných při diagnóze 48 pacientů s ALL na 979 různých miRNA. Down-regulované hladiny exprese miR-451 a miR-151-5p a up-regulované hladiny exprese miR-1290 spojené s nepříznivými prognostickými faktory.

Druhá studie se zaměřila na měření tří miR ve vzorcích BM odebraných pacientům s B-ALL při diagnóze léčených protokolem BFM. ProALL miRs předpovídaly vysoké riziko relapsu (p<0,0001, n=127). Bylo zjištěno, že ProALL miR jsou nezávislým prediktorem při testování s prognostickými faktory známými při diagnóze a při testování pomocí PCR-MRD. Podobné nálezy byly zjištěny u pacientů léčených protokolem DCOG (n=32, p<0,0001). V malé studii proveditelnosti výzkumníci ukázali, že ProALL miR měřené v krvi korelovaly s ProALL miR měřené v kostní dřeni (Avigad et al. Profil exprese Mir lymfocytů periferní krve předpovídá relaps u dětské akutní lymfoblastické leukémie. Krev. 2016;128:1736 - Posterová prezentace na ASH 2016).

Zdůvodnění studie:

Ačkoli MRD významně přispěla k podstatnému zvýšení přežití a výsledku pacientů s ALL, téměř 15 % až 20 % mladých pacientů s ALL nakonec podlehne relapsu, což vede k relapsu ALL jako 4. nejčastější dětské malignitě (Locatelli et al., 2012, Pui et al., 2012, Hunger and Mullighaan, 2015). Jakmile dojde k relapsu, pouze 30 % až 50 % pacientů s relapsem může být vyléčeno i intenzivní chemoterapií a transplantací kostní dřeně (Nguyen et al. 2008 a Locatelli et al., 2012). Pacienti s relapsem ALL s vysokou MRD před transplantací hematopoetických kmenových buněk (HSCT) mají významně horší pravděpodobnost přežití bez onemocnění 10 let po zahájení léčby relapsu (Eckert et al., 2015). Je tedy logické, že včasná detekce relapsu před velkým zvýšením MRD může zlepšit přežití pacientů s relapsem bez onemocnění. Přesto mnoho onkologických skupin nezahrnuje monitorování do VŠECH léčebných protokolů kvůli pracnosti měření MRD; a zneplatnění proveditelnosti rutinního monitorování MRD. To je způsobeno faktory, jako je variabilní kinetika opětovného růstu leukemických buněk (van Dongen et al., 2015), a že téměř 50 % pacientů s ALL podlehne relapsu nového klonu leukémie, který nebyl při diagnóze identifikován (Choi et al., 2007 ). Frekvence monitorování může být také omezena, zejména u dětí, kvůli nepohodlí a praktickým potížím, které představuje aspirace BM (Coustan-Smith E. et al., 2002). Jednoduchý prediktivní test na ALL v krvi by zvýšil praktičnost častějšího testování pacientů s ALL a mohl by nakonec vést k prevenci relapsu pomocí preemptivní léčby.

Zkoumání, zda lze ProALL miRs měřit v krvi, kromě BM, pro predikci rizika relapsu u pacientů s ALL je životně důležité kvůli mnoha výhodám takového krevního testu. Pokud lze hladiny ProALL testovat častěji v krvi, zvýší se pravděpodobnost úspěšné léčby leukémie pacientů tím, že potenciálně umožní lékaři přijmout preventivní opatření k prevenci předpokládaného relapsu.

Studovat design:

Studie bude provedena ve dvou fázích:

Stupeň 1 – průřezová studie: Vzorky krve budou odebírány od relabujících pediatrických pacientů s B-ALL a pacientů s B-ALL v remisi. Od každého pacienta budou odebrány tři vzorky krve do zkumavek, aby bylo možné interpretovat nejlepší zdroj krve pro měření miR-451, miR-151-5p a miR-1290. Zdroje, které budou testovány, jsou sérum, lymfocyty periferní krve a plná krev. Hladina miR v krvi bude porovnána mezi pacienty s relapsem B-ALL a pacienty s B-ALL v remisi (n=30). Pokud bude studie „Stage 1 Cross-Sectional“ úspěšná, budou zkoušející pokračovat v klinické studii do studie „Stage 2 Prospective Monitoring“.

Fáze 2 – Prospektivní monitorovací studie: Krev bude pacientům odebírána při diagnóze a/nebo při běžném klinickém sledování. Pacientům může být až pět let od diagnózy (n≈65 *3 vzorků). Bude odebrán jeden zdroj krve. Pacienti budou sledováni po dobu 3 let. Konečný návrh studie 2. etapy bude po dokončení studie 1. etapy.

Úvahy o velikosti vzorku:

Průřezová studie fáze 1: Pro výpočet velikosti vzorku je primárním koncovým bodem testování schopnosti ProALL miR měřených v krvi odlišit pacienty s B-ALL v remisi od pacientů v relapsu. Výpočet velikosti vzorku je podle Sampling: porovnání podílů MedCalc (MedCalc Statistical Software verze 16.1 (MedCalc Software bvba, Ostend, Belgie; https://www.medcalc.org; 2016). Chyba typu 1 byla 0,05 a chyba typu 2 byla 0,20. Data pro výpočet velikosti vzorku byla získána z kohorty DCOG v Avigad et al., 2016, která byla vybrána jako model pro studii proveditelnosti kvůli své malé velikosti (n=32). Průřezová analýza kohorty DCOG ukázala, že bylo významně více pacientů s relapsem (p=0,001, Fisherův exaktní test) pozitivní alespoň na jednu miR (78 %) ve srovnání s pacienty bez recidivy (13 %).

Data jsou převzata z obrázku 6 (od Avigad et al., 2016):

• Pacienti při relapsu - alespoň jedna míra pozitivních miR 0,78
• Pacienti v remisi – bez miR pozitivní četnost 0,13
• Relaps/remise byla 0,39
• Minimální potřebný počet přihlášených je: a. Pacienti v relapsu - n=8 ab. Pacienti v remisi - n=21.

Pacienti s B-ALL mohou být zařazeni do studie do pěti let od diagnózy. Po dokončení zařazení do průřezové studie bude PI u pacientů dotázán na stav remise/relapsu. Výše je uveden minimální počet pacientů, kteří mají být zařazeni. Může být zařazeno až 12 pacientů v relapsu a 31 pacientů v remisi.

Prospektivní studie fáze 2: Výpočet velikosti vzorku je podle vzorkování: analýza přežití (Time-to-Event) MedCalc. Chyba typu 1 byla 0,05 a chyba typu 2 byla 0,20. Data pro výpočet velikosti vzorku byla získána z obrázku 3A Kaplan Meirovy křivky (Avigad et al., 2016).

• Míra přežití Profil B byla 0,77
• Míra přežití Profil A byla 0,29
• Profil B/Profil A byl 17
• Potřebný počet přihlášených je 62

Od každého pacienta by měly být odebrány alespoň 3 vzorky ze 3 časových bodů. Vzorek lze odebrat při relapsu, pokud se jedná o 2. nebo 3. vzorek. Pacienti ze stadia 1 mohou pokračovat do stadia 2. Konečný design studie bude po 1. stupni.

Odběr krve a manipulace se vzorky:

Při jedné návštěvě nebude odebráno více než 0,8 ml krve na kilogram hmotnosti přihlášeného. Celkové množství krve, které má být odebráno pro fázi 1, je mezi 7,5 ml až 10,5 ml podle následujícího:.

• Zkumavka PaxGene – 2,5 ml
• Zkumavka pro plazmu - 2,5 ml až 4 ml
• Zkumavka pro sérum - 2,5 ml až 4 ml

Výsledky biomarkerů a tok klinických dat:

• Vzorky krve budou testovány na ProALL miRs Curewize Lab.
• Curewize obdrží klinická data odpovídající návštěvě, že screenovaný vzorek krve byl odebrán, až po zaslání miR hodnot krevního vzorku do klinického pracoviště.

Plán statistické analýzy (SAP) pro 1. fázi průřezové průřezové studie:

Proměnné krevních biomarkerů:

• úroveň relativní exprese miR-451 (ddCt).
• úroveň relativní exprese miR-151-5p (ddCt).
• úroveň relativní exprese miR-1290 (ddCt).

kovarianty:

• Stáří
• Rod
• MRD-PCR
• BFM riziko
• Léčebná skupina
• Počet bílých krvinek při diagnóze a při odběru krve, pokud je rutinně testován.
• Steroidní odezva
• Cytogenetické proměnné

Průřezová analýza:

Fáze-1 je považována za průzkumnou a bude použita k návrhu analýzy fáze-2.

Proměnné budou testovány na normalitu pomocí testu Shapiro Wilka. Hladina exprese miR-451, miR151-5p a miR-1290 bude porovnána mezi pacienty během remise a pacienty během relapsu pomocí Mann-Whitney U testu. Průběžná data budou znázorněna v krabicových grafech zobrazujících medián a mezikvartilové rozmezí. Logistická regrese bude použita k testování hodnot miR [nominální (pozitivní/negativní) a kontinuální] mezi sebou a s dalšími proměnnými porovnávajícími pacienty v remisi a pacienty v relapsu. Optimální kombinace Klasifikátor bude vytvořen podle výše uvedené analýzy. Kategoriální proměnné budou shrnuty do frekvenčních tabulek, udávajících počty a frekvence miR stavu (pozitivní versus negativní). Data budou porovnána pomocí Fisher exclusive pro dichotomické (2x2 tabulky) hodnoty nebo chí-kvadrát nebo chí-kvadrát pro trend pro tabulky. Budou vypočítány poměry šancí a pravděpodobnosti. Budou vytvořeny křivky provozních charakteristik přijímače, nezávisle proměnné jsou miR-451 nebo miR-151-p, miR-1290 a závislou proměnnou je relaps nebo remise. Pro kombinovaný klasifikátor budou vytvořeny křivky provozních charakteristik přijímače. Dodatečné analýzy budou provedeny, pokud výsledky plánovaných analýz poskytnou přiměřenou podporu.