Evaluering av ProALL miRs i blodprøver for prediksjon av ALL tilbakefallsrisiko

Akutt lymfatisk leukemi risikobasert behandling:

Barn med ALL blir vanligvis behandlet i henhold til risikogrupper definert av både kliniske og laboratoriemessige egenskaper. Denne tilnærmingen gjør at barn med tegn på historisk svært godt resultat kan behandles med beskjeden terapi og spares for mer intensiv og toksisk behandling, samtidig som det lar barn med historisk lavere sannsynlighet for langtidsoverlevelse få mer intensiv terapi som kan øke ALL pasientenes mulighet for helbredelse. Studiegrupper bruker varierende kriterier, med stor vekt på målinger av minimal restsykdom (MRD) som kvantifiserer antall leukemiceller som forblir i pasienten under og etter behandling. De mest brukte MRD-analysene er basert på polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon av antigen-reseptorgener, og på flowcytometrisk påvisning av unormale immunfenotyper (Campana, 2010). Disse teknikkene identifiserer pasientens spesifikke leukemiklon i benmargen før induksjonsbehandling og måler antall gjenværende leukemiceller etter induksjon. To mye brukte eksempler på risikostratifiseringsprotokoller er Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) Protocol i Europa og Children's Oncology Group Protocol i USA.

Tidligere ProALL miR-funn:

ProALL-prototypeanalysen mikroRNA (miRNA) (Avigad et al., 2016) ble oppdaget ved mikroarray-analyse ved hybridisering av BM-aspirater tatt ved diagnose av 48 ALL-pasienter til 979 forskjellige miRNA. De nedregulerte ekspresjonsnivåene av miR-451 og miR-151-5p og det oppregulerte ekspresjonsnivået til miR-1290 assosiert med ugunstige prognostiske faktorer.

Den andre studien fokuserte på å måle de tre miRene i BM-prøver tatt fra B-ALL-pasienter ved diagnose behandlet med BFM-protokollen. ProALL miRs spådde høy risiko for tilbakefall (p<0,0001, n=127). ProALL miRs ble funnet å være en uavhengig prediktor når de ble testet med prognostiske faktorer kjent ved diagnose og når de ble testet med PCR-MRD. Lignende funn ble funnet for pasienter behandlet med DCOG-protokollen (n=32, p<0,0001). I en liten mulighetsstudie viste etterforskerne at ProALL miRs målt i blod korrelerte med ProALL miRs målt i benmarg (Avigad et al. Mir-ekspresjonsprofil for perifere blodlymfocytter forutsier tilbakefall ved akutt lymfoblastisk leukemi hos barn. Blod. 2016;128:1736 - Plakatpresentasjon på ASH 2016).

Studiebegrunnelse:

Selv om MRD i stor grad har bidratt til den betydelige økningen i ALL-pasienters overlevelse og resultat, bukker nesten 15 % til 20 % av unge ALL-pasienter til slutt etter for tilbakefall, noe som resulterer i residiverende ALL som den fjerde vanligste maligniteten i barndommen (Locatelli et al., 2012, Pui et al., 2012, Hunger og Mullighaan, 2015). Når tilbakefall inntreffer, kan bare 30 % til 50 % av tilbakefallende pasienter helbredes selv med intensiv kjemoterapi og benmargstransplantasjon (Nguyen et al. 2008 og Locatelli et al., 2012). Tilbakefall ALLE pasienter med høy MRD før hematopoetisk stamcelletransplantasjon (HSCT) har betydelig dårligere sannsynlighet for sykdomsfri overlevelse 10 år etter at tilbakefallsbehandlingen starter (Eckert et al., 2015). Derfor er det naturlig at tidlig oppdagelse av tilbakefall før en stor økning i MRD kan forbedre sykdomsfri overlevelse for tilbakefallspasienter. Likevel, mange onkologigrupper inkluderer ikke overvåking i ALLE behandlingsprotokoller på grunn av arbeidsintensiteten til MRD-måling; og ugyldiggjøring av gjennomførbarheten av rutinemessig MRD-overvåking. Dette skyldes faktorer som variabel kinetikk for gjenvekst av leukemiceller (van Dongen et al., 2015), og at nesten 50 % av ALLE pasienter bukker under for tilbakefall fra en ny leukemiklon som ikke ble identifisert ved diagnose (Choi et al., 2007) ). Hyppigheten av overvåking kan også være begrenset, spesielt hos barn, på grunn av ubehag og praktiske vansker som følge av BM-aspirasjon (Coustan-Smith E. et al., 2002). En enkel prediktiv test for ALL i blod vil øke det praktiske ved å teste ALLE pasienter oftere og kan til slutt føre til forebygging av tilbakefall ved hjelp av forebyggende behandling.

Å undersøke om ProALL miRs kan måles i blod, i tillegg til BM, for å forutsi tilbakefallsrisiko hos ALLE pasienter er avgjørende på grunn av de mange fordelene med en slik blodprøve. Hvis ProALL-nivåer kan testes oftere i blod, vil sannsynligheten for vellykket behandling av pasientens leukemi øke ved å potensielt gjøre det mulig for legen å ta forebyggende tiltak for å forhindre forutsagt tilbakefall.

Studere design:

Studien vil bli utført i to stadier:

Trinn 1-tverrsnittsstudie: Blodprøver vil bli tatt fra residiverende pediatriske B-ALL-pasienter og B-ALL-pasienter i remisjon. Tre blodprøver vil bli tatt fra hver pasient i rør for å tolke den beste blodkilden for måling av miR-451, miR-151-5p og miR-1290. Kildene som skal testes er serum, perifere blodlymfocytter og fullblod. Nivået av miR i blod vil bli sammenlignet mellom residiverende B-ALL-pasienter og B-ALL-pasienter i remisjon (n=30). Hvis "Stage 1 Cross-Sectional"-studien er vellykket, vil etterforskerne fortsette den kliniske studien til "Stage 2 Prospective Monitoring"-studien.

Trinn 2-Prospektiv overvåkingsstudie: Blod vil bli samlet inn fra pasienter ved diagnose og/eller ved rutinemessig klinisk oppfølging. Pasienter kan være opptil fem år fra diagnose (n≈65 *3 prøver). Én blodkilde vil bli samlet inn. Pasientene vil bli fulgt i 3 år. Den endelige utformingen av trinn 2-studien vil være etter at trinn 1-studien er fullført.

Betraktninger om prøvestørrelse:

Trinn 1 tverrsnittsstudie: For prøvestørrelsesberegningen er det primære endepunktet å teste evnen til ProALL miRs målt i blod til å skille B-ALL-pasienter ved remisjon fra pasienter ved tilbakefall. Prøvestørrelsesberegningen er i henhold til Sampling: sammenligning av proporsjoner av MedCalc (MedCalc Statistical Software versjon 16.1 (MedCalc Software bvba, Oostende, Belgia; https://www.medcalc.org; 2016). Type 1 feil var 0,05 og type 2 feil var 0,20. Data for prøvestørrelsesberegningen ble hentet fra DCOG-kohorten i Avigad et al., 2016, som ble valgt som modell for mulighetsstudien på grunn av dens lille størrelse (n=32). Tverrsnittsanalyse av DCOG-kohorten viste at det var signifikant flere pasienter med tilbakefall (p=0,001, Fisher Exact-test) positiv for minst én miR (78 %) sammenlignet med pasienter uten tilbakefall (13 %).

Data er hentet fra figur 6 (fra Avigad et al., 2016):

• Pasienter ved tilbakefall - Minst én miR positiv rate 0,78
• Pasienter ved remisjon - Ingen miR positiv rate 0,13
• Tilbakefall/remisjon var 0,39
• Minimum antall påmeldte er: a. Pasienter ved tilbakefall - n=8 og b. Pasienter ved remisjon - n=21.

B-ALL-pasienter kan inkluderes i studien inntil fem år fra diagnose. Etter å ha fullført registreringen av tverrsnittsstudien, vil PI bli spurt om remisjon/tilbakefallsstatus for pasienter. Over er minimum antall pasienter som skal registreres. Opptil 12 pasienter ved tilbakefall og 31 patenter ved remisjon kan registreres.

Trinn 2 Prospektiv studie: Prøvestørrelsesberegningen er i henhold til Sampling: Survival analyse (Time-to-Event) av MedCalc. Type 1 feil var 0,05 og type 2 feil var 0,20. Data for prøvestørrelsesberegningen ble hentet fra figur 3A Kaplan Meir-kurve (Avigad et al., 2016).

• Overlevelsesrate Profil B var 0,77
• Overlevelsesrate Profil A var 0,29
• Profil B/Profil A var 17
• Antall påmeldte er 62

Minst 3 prøver fra 3 tidspunkter bør tas fra hver pasient. Det kan tas prøve ved tilbakefall dersom det er 2. eller 3. prøve. Pasienter fra trinn 1 kan fortsette til trinn 2. Den endelige utformingen av studien vil være etter trinn 1.

Blodekstraksjon og håndtering av prøver:

Ikke mer enn 0,8 ml blod per kilo av deltakerens vekt vil bli samlet inn ved ett besøk. Den totale mengden blod som skal samles inn for trinn 1 er mellom 7,5 mL til 10,5 mL i henhold til følgende:.

• PaxGene Tube - 2,5 ml
• Rør for plasma - 2,5 mL til 4 mL
• Rør for serum - 2,5 mL til 4 mL

Biomarkørresultater og klinisk dataflyt:

• Blodprøvene vil bli screenet for ProALL miRs av Curewize Lab.
• Curewize vil motta kliniske data tilsvarende besøket at den screenede blodprøven ble tatt først etter å ha sendt det kliniske stedet blodprøvens miR-verdier.

Statistisk analyseplan (SAP) for trinn 1-tverrsnittsstudie:

Blodbiomarkørvariabler:

• miR-451 relative uttrykk (ddCt) nivå
• miR-151-5p relative uttrykk (ddCt) nivå
• miR-1290 relative uttrykk (ddCt) nivå

Kovariater:

• Alder
• Kjønn
• MRD-PCR
• BFM risiko
• Behandlingsgruppe
• Antall hvite blodlegemer ved diagnose og ved blodprøvetaking hvis rutinemessig testet.
• Steroidrespons
• Cytogenetiske variabler

Tverrsnittsanalyse:

Trinn-1 anses som utforskende og vil bli brukt til å designe analysen av trinn-2.

Variabler vil bli testet for normalitet med Shapiro Wilks test. Ekspresjonsnivået til miR-451, miR151-5p og miR-1290 vil bli sammenlignet mellom pasienter under remisjon og pasienter under tilbakefall ved Mann-Whitney U-test. Kontinuerlige data vil bli avbildet i boksplott som viser median og interkvartilt område. Logistisk regresjon vil bli brukt til å teste miR-verdiene [nominelle (positive/negative) og kontinuerlige] med hverandre og med andre variabler som sammenligner mellom pasienter ved remisjon og pasienter ved tilbakefall. Den optimale kombinasjonen Classifier vil bli opprettet i henhold til analysen ovenfor. Kategoriske variabler vil bli oppsummert av frekvenstabeller, som indikerer tall og frekvenser av miR-status (positiv versus negativ). Data vil bli sammenlignet av Fisher eksakt for dikotome (2x2 tabeller) verdier eller kjikvadrat eller kjikvadrat for trend for tabeller. Oddsforhold og sannsynlighetsforhold vil bli beregnet. Mottakerdriftskarakteristiske kurver vil bli opprettet, de uavhengige variablene er miR-451 eller miR-151-p, miR-1290 og avhengig variabel er tilbakefall eller remisjon. Mottakerdriftskarakteristiske kurver vil bli opprettet for den kombinerte klassifikatoren. Ytterligere analyser vil bli utført dersom resultater fra planlagte analyser gir rimelig grunn.