Gentamicin pro RDEB

Cíl 1. Vyhodnotit bezpečnost a účinnost krátkodobého intravenózního gentamicinu u pacientů s RDEB.

Přehled a zdůvodnění: Zdůvodnění pro krátkodobý systémový intravenózní gentamicin u těchto pacientů je nastíněno v oddílech výše, jmenovitě lék by mohl léčit více kožních míst současně, včetně jícnu. Tento přístup se ukázal jako bezpečný a účinný u jiných genetických onemocnění, jako je CF a DMD22-25. Naše HYPOTÉZA je, že intravenózní gentamicin, stejně jako topický a intradermální gentamicin, vytvoří nové C7 a AF na pacientově DEJ, zlepší více kožních míst současně, zlepší klinického onemocnění pacienta a zlepšit kvalitu jeho života. V souladu s přiloženými dopisy dvou zkušených pediatrů věříme, že tato terapie bude bezpečná. Protože C7 a AF jsou neuvěřitelně stabilní, dále předpokládáme, že nově indukované C7 a AF budou v kůži pacienta přetrvávat po mnoho měsíců. Pomocí dávkovacích režimů gentamicinu, které se ukázaly jako bezpečné, budeme: 1) určit procento zvýšení exprese C7 v kůži pacientů před a po léčbě, 2) určit, jak trvanlivé a udržitelné jsou nové C7 a AF u pacientů kůže po léčbě, 3) určit, zda je tato léčba u této populace pacientů bezpečná, 4) určit, zda tato léčba klinicky zlepšuje pacienty a zlepšuje kvalitu jejich života a 5) generovat data pro multicentrickou studii fáze III pomocí většího počet pacientů.

Pacienti/intervence: Již jsme seřadili 3 dobře charakterizované dospělé pacienty s RDEB s nesmyslnými mutacemi, kteří se chtějí této studie zúčastnit. Tito pacienti měli v naší klinické studii pozitivní odpovědi na topický a intradermální gentamicin (tabulka II). Pacienti budou dostávat intravenózně gentamicin (7,5 mg na kilogram) ve 100 ml 5% dextrózy ve fyziologickém roztoku po dobu 14 po sobě jdoucích dnů, v dávce, u které se prokázalo, že nezpůsobuje ototoxicitu ani neprhotoxicitu28 a je účinná při navození odečítání PTC u pacientů s DMD .22 Prvních několik infuzí bude provedeno v infuzním centru nemocnice Keck v USC. Změříme minimální hladiny gentamicinu (24 hodin po infuzi) a maximální hladiny gentamicinu (30 minut po infuzi) během druhého dne a v případě potřeby upravíme dávky gentamicinu tak, aby maximální hladina byla mezi 20 a 40 μg/ml a minimální hladina <2 μg/ml. Pokud se nevyskytnou žádné nežádoucí vedlejší účinky, budou pacienti dostávat infuze doma prostřednictvím komerční infuzní služby.

Hodnocení bezpečnosti: Pacienti budou schváleni, zařazeni a vyhodnoceni v den 0 a poté vyhodnoceni ve dnech 30, 90 a 180 po léčbě. V den 0 budou mít pacienti kompletní anamnézu, přehled systémů (ROS), fyzikální vyšetření, vitální funkce a hmotnost. Budou mít také základní analýzu moči, kompletní krevní obraz (CBC), elektrolyty, glukózu, komplexní metabolický panel (CMP) a vypočítanou clearance kreatininu. Čistá tónová audiometrie a vypočtená clearance kreatininu se provede ve dnech 0, 7, 14 a 30 po léčbě. Kritériem zastavení bude pokles o >15 dB na čisté tónové audiometrii při 2 po sobě jdoucích frekvencích a clearance kreatininu <60ml/min.28 Kdykoli se u pacienta vytvoří nový protein, existuje možnost, že imunitní systém pacienta proti němu vytvoří autoprotilátky. V naší klinické studii s topickým a intradermálním gentamicinem k tomu nedošlo, ale musíme to znovu zhodnotit s intravenózním gentamicinem a potenciálně vytvořeným více autoantigenním proteinem. Pomocí nepřímé imunofluorescence a naší anti-C7 ELISA budeme testovat sérum subjektu na protilátky anti-C7 při každé návštěvě.

Účinnost: A. Klinická hodnocení: Ve výchozím Dni 0 a při každé následné návštěvě (30., 90. a 180. den) pacienti dokončí nástroj pro hodnocení kvality života, nástroj pruritus Score a ověřenou aktivitu onemocnění epidermolysis bullosa index (EBDASI)29,30. Pacienti si budou vést denní deník pomocí vlastního dotazníku ROS. Pacientům bude každý týden telefonovat člen studie USC s dotazem na jakékoli nové příznaky, symptomy nebo změny ROS od začátku studie. Ve výchozím Dni 0 identifikujeme čtyři testovací místa o velikosti alespoň 25 cm2, která budeme postupně sledovat. Dva budou z oblastí, které mají na začátku puchýře nebo eroze, a další dva z oblastí neporušené kůže. Dvě testovací místa s aktivními puchýři a erozemi budou vytyčena pomocí průhledné fólie a plochy lézí se vypočítají na digitalizační tabletě. Podobně budou mít všechna testovací místa standardizované fotografie a plochy lézí vypočítané počítačově podporovanou morfometrií, jak bylo dříve publikováno.29-31 V rámci svého denního deníku si pacienti zaznamenají počet nových puchýřů a erozí, které se vyskytují na testovacích místech. Člen studie USC zatelefonuje pacientovi každý týden a zeptá se ho na testovací místa a požádá pacienta, aby odhadl procento plochy testovacího místa spotřebovaného erozemi a puchýři. Při každé následné návštěvě budou tři dermatologové pozorovat čtyři testovací místa a spočítat počet bulí a erozí na každém z nich. Neporušené oblasti testovacího místa budou hodnoceny při každé následné návštěvě pomocí následující 3-bodové stupnice: 0 = žádné léze; +1 = jakékoli aktivní léze; +2 = aktivní léze zabírající více než 50 % plochy testovacího místa. Budou provedeny trasování pro hodnocení oblastí puchýřů nebo otevřených erozí a budou provedeny standardizované fotografie spárované s počítačově podporovanou morfometrií pro výpočet oblastí jakýchkoli lézí. B. Vyhodnocení exprese C7 a AF: V každém časovém bodě po léčbě budou biopsie 8 mm děrované ze čtyř testovacích míst rozděleny do tří částí pro (i) histologii H&E a kvantifikaci epidermální-dermální adherence, (ii) exprese C7 na DEJ vzhledem k normální lidské kůži s použitím anti-C7 protilátek proti doménám NC1 a NC2 softwaru C7 a NIH J Image. Jedním z hlavních "milníků" studie bude exprese NC2, protože by to jasně indikovalo obnovení kompletního hodnocení C7 a (III) nově vytvořených AF pomocí imuno-EM a AF počítání pomocí počítačem podporované morfometrie. Provádění těchto hodnocení po dobu 6 měsíců určí, jak odolné jsou nově vytvořené C7 a AF. V naší nedávné klinické studii nastíněné výše bylo překvapivé, že gentamicinem indukovaný C7 zůstal na podobné úrovni 3 měsíce po léčbě jako 1 měsíc u pacienta #3 (viz obr. 1 a tabulka II).

Cíl 2: Vyhodnotit bezpečnost a účinnost vyšší dávky topického gentamicinu u pacientů s RDEB.

Přehled a zdůvodnění: V naší klinické studii s gentamicinem, která byla nastíněna dříve, došlo k významným změnám v produkci nových C7 a AF, jak ukazuje tabulka II. Pacienti #2 a #5 obnovili C7 pouze na 20 % normální kůže v reakci na gentamicin. Použili jsme pouze jednu koncentraci gentamicinu, 0,1% mast, a naše studie in vitro s fibroblasty RDEB od těchto dvou pacientů ukázaly, že odpověď C7 na gentamicin byla závislá na dávce.26 U těchto pacientů mohlo být suboptimální dávkování nebo suboptimální přístup gentamicinu k dermálním fibroblastům a bazálním keratinocytům pacienta. V tomto cíli použijeme 0,5% gentamicinovou mast spíše než 0,1% a určíme, zda je odpověď C7 u těchto dvou pacientů robustnější. Na základě našich povzbudivých údajů uvedených na obrázku 2 také ošetříme neporušenou kůži a určíme, zda vyšší dávka gentamicinu může profylakticky zabránit vzniku otevřených kožních puchýřů a erozí.

Pacienti/intervence: Budeme studovat dvě RDEB děti testované v naší předchozí studii pro tuto studii. Kromě toho máme také další 2 děti a 2 další dospělé pacienty, kteří nás kontaktovali a chtějí se této studie zúčastnit (tabulka III). Dva z těchto pacientů sdílejí stejné mutace (R578X a R2814) jako naši současní pacienti. Vybereme celkem čtyři testovací místa (dvě s otevřenými ranami o velikosti alespoň 3 cm x 3 cm a dvě oblasti neporušené kůže v blízkosti testovacích míst s puchýři nebo erozemi) a aplikujeme 0,5% gentamicinovou mast dvakrát denně pod okluzivní krytí dle volby pacienta po dobu dvou týdnů. Tato dávka byla použita v kombinaci s 15% paromomycinem k ulcerózním kožním leishmaniózám jednou denně po dobu 20 dnů ve dvou publikacích bez zjištěné renální nebo ototoxicity.32,33 Bezpečnost a účinnost: U těchto pacientů v podstatě vyhodnotíme parametry bezpečnosti a účinnosti uvedené v cíli č. 1 v 1., 3. a 6. měsíci po topické aplikaci. Potenciální renální toxicita a ototoxicita bude monitorována pomocí clearance kreatininu a čisté tónové audiometrie v den 0 a při každé následné návštěvě.

Cíl 3: Vyhodnotit bezpečnost a účinnost intradermálního podání gentamicinu pomocí mikrojehlového válečkového zařízení MR2.

Přehled a zdůvodnění: V naší současné klinické studii nastíněné výše byly u několika pacientů vynikající odpovědi C7 na intradermální injekce roztoku gentamicinu (tabulka II). Nicméně tyto injekce byly velmi lokalizované s difúzí léku pravděpodobně méně než palec od jediného místa vpichu. Nedávné důkazy ukázaly, že zařízení s mikrojehlovým válečkem MR2 může snadno dodávat lidokain do spodní epidermis a horní papilární dermis přes širokou oblast kůže s dobrou účinností, bezpečností a vynikající snášenlivostí pacientem.34 Může to být příležitost k podání intradermálního roztoku gentamicinu (40 mg/ml) do širokých oblastí kůže jednoduchým způsobem, který lze provést v ambulanci s minimálními logistickými problémy a zamezení systémové expozice léku. Mezi výhody patří možnost dodávání "pulsním" způsobem významných hladin gentamicinu do papilární dermis přes široké oblasti kůže s minimálním nepohodlím a minimální systémovou expozicí gentamicinu. Vyhnout se systémové expozici by bylo cenné pro pacienty s RDEB, kteří mají ototoxicitu nebo renální ohrožení, špatný žilní přístup nebo nemohou tolerovat intravenózní infuze.

Pacienti a intervence: Do této studie „důkazu principu“ zařadíme dva nové pacienty s RDEB (buď dospělé nebo děti) uvedené v tabulce III. Místa kožního testu budou plochy o rozměrech alespoň 40 cm2 a budeme testovat jedno místo neporušené neporaněné kůže a jedno místo kůže s lézemi (puchýřky nebo eroze). Oblasti budou vyčištěny pomocí 4% Hibiclens a poté bude zařízení MR2 s mikrojehličkovým válečkem protaženo přes oblast ve dvou směrech pod úhlem 90 stupňů. Toto zařízení vyvolává drobné mikrorány v kůži až do hloubky papilární dermis. Poté se na oblast hojně aplikuje sterilní roztok gentamicinu (40 mg/ml) a oblast se okamžitě okluduje polyuretanovou membránou (Opsite). Další stejně velké testovací místo neporušené kůže bude testováno bez předchozího zásahu pomocí mikrojehlového válečku. Stejný roztok gentamicinu bude aplikován na místo a okamžitě uzavřen přípravkem Opsite. To určí, zda roztok gentamicinu může proniknout do neporušené kůže.

Bezpečnost a účinnost: Změříme gentamicin v séru těchto pacientů 30 minut po aplikaci mikrojehly, abychom určili, zda existuje nějaká systémová expozice, když je gentamicin podáván tímto způsobem. Účinnost podávání gentamicinu bude hodnocena stejně jako u Cíle č. 1 pomocí IF a imuno-EM analýzy ve spojení s pacienty, kteří si vedou denní deník ošetřovaných míst, týdenní fotografie testovacích míst, týdenní rozhovory pacientů s personálem a hodnocení lékařem při návštěvách pacienta v 1., 3. a 6. měsíci po podání gentamicinu. Potenciální renální toxicita a ototoxicita bude monitorována pomocí clearance kreatininu a čisté tónové audiometrie v den 0 a při každé následné návštěvě.