Immunrespons og resultat efter aortaklapkirurgi (mål) (Measure)

Eksperimentelt design og metoder:

Indstilling:

Barts Heart Center er et specialisthjertecenter med 255 senge, hvor der udføres ca. 200 primære isolerede åbne aortaklapudskiftningsprocedurer om året. Det er tæt forbundet både geografisk og akademisk med William Harvey Research Institute (WHRI), som er en del af Queen Mary University, London (QMUL). Dette vil muliggøre laboratorieanalyse af alle indsamlede blodprøver inden for 15 minutter, hvis det er nødvendigt. Barts Heart Center er en af ​​de største hjerteenheder i Europa, og et centralt forskningsmål for QMUL/WHRI er at støtte hjerteforskning.

Prøveindsamling og opbevaring:

Efter skriftligt informeret samtykke vil alle patienter blive præoperativt risikobedømt ved hjælp af ASA, Euroscore 2 og konventionelt risikobedømt for udvikling af infektion på operationsstedet.

Blod (44 ml i alt) vil blive taget fra 150 aortaklappatienter umiddelbart før operationen (T0).

Blod (7 ml) vil blive opsamlet i et PAXgene-rør og opbevaret ved -80° til senere genetisk analyse. En koaguleret prøve (7 ml) vil blive opsamlet i et standard SST-rør med guldtop, efterladt til koagulering og derefter centrifugeret i 10 minutter ved 1000 g, serummet adskilt og opbevaret ved -80° til senere analyse af antistofniveauer. Derudover vil der blive taget 30 ml blod til undersøgelse af perifere blod mononukleære celler (PBMC'er), trukket ind i standard lilla top EDTA rør (antikoagulant). Disse adskilles inden for 3 timer efter opsamling ved Ficoll-Paque densitetsgradientcentrifugering, hvorved PBS-fortyndet blod omhyggeligt lægges over Ficoll og bremses af i en centrifuge ved 400 g i 30 minutter. PBMC-laget ekstraheres derefter og vaskes to gange i PBS og opbevares i 10% dimethylsulfoxid-fryseopløsning i flydende nitrogen, så de kan optøs, og batch-analyseres på et senere tidspunkt.

Prøveanalyse:

PBMC'er vil blive talt ved hjælp af et hæmocytometer, derefter dyrket i RPMI og 10% serum med enten LPS, α-toksin eller ustimuleret i 24 timer, hvorefter de straks vil blive analyseret som beskrevet nedenfor.

• Opløselige mediatorer (plasma)

• Opbevaring: Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) antikoaguleret blod vil blive centrifugeret (1200 g, 10 minutter, 20 °C) og plasma opbevaret ved -80 °C inden for 2 timer efter opsamling
• Analyse:

Cytokiner: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatory Panel 1 vil blive anvendt til at kvantificere IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 IL-8 og TNF-a. Pladerne vil blive læst ved hjælp af en MSD QuickPlex SQ 120 imager (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Antistoffer: Disse vil blive målt ved hjælp af ELISA-assays mod stafylokokkantigener (α-toksin, teichoinsyre) og kernedele af endotoksinmolekylet (EndoCAb).

• Fuldblods LPS/α-toksin Stimuleret cytokinfrigivelse

  • Teknik: Som tidligere beskrevet og valideret i vores laboratorium, vil hepariniseret blod blive stimuleret i 4 timer (37°C, 250rpm) med 1 ng/ml LPS inden for 2 timer efter udtagning. Efter inkubation centrifugeres prøverne (1200 g, 10 minutter, 20 °C) og supernatanten opbevares ved -80 °C.
  • Cytokin-kvantificering: I henhold til 'opløselige mediatorer' vil MSD V-PLEX Proinflammatory Panel 1 blive anvendt til at kvantificere TNF-α (primært resultat som mål for immunkompetence) og andre cytokiner. Cytokiner vil blive udtrykt som en faktor af antallet af cirkulerende monocytter.

• Flowcytometrisk immunfænotypning og funktionel vurdering af leukocytter

  • Flowcytometri: Alle prøver vil blive analyseret på den samme maskine (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Standardisering og sammenligning af output vil blive opnået via anvendelse af konstante spændinger og kompensationsmatrix hele vejen igennem med daglig matchning af værdier til en enkelt batch af Cytometri Setup and Tracking (CS&T) perler (BD). Leukocytcelleoverfladefarvning vil blive udført ved hjælp af antistoffer, der hovedsagelig leveres af BD. Farvning, datafangst og lagring vil blive udført i overensstemmelse med en enkelt undersøgelsesstandarddriftsprocedure. 5 paneler (op til 14 farver) og to funktionelle analyser vil blive udført på hvert tidspunkt. Data vil blive analyseret i FlowJo version 10.5.
  • Farvning af overflademarkør:

Kvantificerings- og kalibreringspanel: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, udført i et BD TruCount-rør for at muliggøre optælling af celleundersæt Cellespecifikke paneler (inkorporerer markører for underkategorisering og markører for immunkompetence)

• Monocyt/myeloid: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofil: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymfocyt: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR Ekspression: Vil blive kvantificeret på CD14+ monocytter ved hjælp af BD QuantiBrite perler.

  • Funktionelle foranstaltninger Fagocytose: Neutrofilers og monocytters evne til at fagocytere opsoniserede FITC-mærkede E.coli-bakterier vil blive kvantificeret via PhagoTest-assayet (BD) i henhold til producentens instruktioner Reaktivt oxygen-'udbrud': Kvantitativ bestemmelse af leukocyt-oxidativt udbrud vil blive foretaget PhagoBurst-assayet (BD) som svar på umærket opsoniseret E.coli, phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og det kemotaktiske peptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o De præ-kirurgiske prøve-PBMC'er, der vil blive stimuleret med LPS (type og koncentration, der optimeres via dosisresponskurve på raske frivillige) og α-toksin vil gennemgå flowcytometri for at måle TLR4 og TLR5 overfladeekspression, HLA-DR overfladeekspression og kvantificering af NF-kB ved hjælp af passende antistoffer valideret i litteraturen. Ved afslutningen af ​​stimuleringen vil cellerne blive høstet, og RNA ekstraheret til kvantitativ (q)PCR for at evaluere AID-mRNA-ekspression. Selvom B-celler i PBMC-kulturerne er blevet stimuleret i nærvær af andre celletyper, primært T-celler og monocytter-makrofager, er vores endepunkt at måle en B-celle-respons, da AID udelukkende udtrykkes i B-celler.

Der er tilstrækkeligt med sundt frivilligt blod tilgængeligt, så alle ovennævnte teknikker kan praktiseres tilstrækkeligt og optimeres før patientrekruttering.

Yderligere prøvetagningstidspunkter vil være umiddelbart efter operation (T1), 24 timer efter operation (T2), udskrivelse (T3) og 4 uger efter operation ved kirurgisk opfølgning (T4). Blodet opsamlet ved 4-ugers opfølgning efter operationen vil blive analyseret for IgG-antistofanalyse mod EndoCAb, α-toksin og teichoinsyre. Dette vil muliggøre et mål for klasseswitch-rekombination. Hvilket vil kunne henvises tilbage til graden af ​​ekspression af AID mRNA.

Populationen af ​​aortaklappatienter vil blive fulgt op for mortalitet og større sygelighed. De vil blive bedømt i henhold til C-POMS (cardiac post-operative morbidity score), længden af ​​ITU-opholdet og længden af ​​hospitalsopholdet. Patienterne vil blive overvåget for udvikling af infektion på operationsstedet (SSI) eller erhvervelse af postoperativ hospitalserhvervet infektion (HAI). Opfølgning efter udskrivelse for sårinfektion eller sammenbrud fortsættes i 12 måneder.

På det umiddelbart præoperative tidspunkt (T0) er det sammen med de aktuelt accepterede mål for immunrespons det hensigten at udføre en nærpatienttest af immunrespons (LIT) ved hjælp af en håndholdt kemiluminescensanordning, der er afhængig af leukocytoxidativt udbrud til en supramaksimal stimulus (Oxford Medistress). Dette afhænger af analyse af responsen i en 10mcl frisk kapillær blodprøve.

Statistiske overvejelser:

Fra offentliggjorte data fra centre verden over er det kendt, at en del af patienterne udvikler en infektion, enten kirurgisk infektion (SSI) eller hospitalserhvervet infektion (HAI), efter aortaklapkirurgi. Det er også kendt, at disse patienter udholder længere ophold på hospitalet efter operationen.

Efterforskerne har vist, at der blandt disse patienter er variation i niveauer af antistoffer mod forskellige perioperative trusler, nemlig endotoksin og stafylokokker.

Efterforskerne har påvist, at der hos patienter, som gennemgår operation og har lave niveauer af cirkulerende antistof mod endotoksin og/eller stafylokokker, er en sammenhæng med større sandsynlighed for at udvikle en infektion og længere postoperativt ophold. Efterforskerne vurderer, at infektionsraten varierer mellem 13,5 - 33%.

Efterforskerne har tidligere foreslået, at sammenhængen mellem antistofniveau og udfald kan være en manifestation af en underliggende svækket evne hos nogle individer til at montere et normalt immunrespons på disse trusler.

Det er kendt, at en del af individer har et unormalt immunrespons. Dette ses måske mest tydeligt i responsen på vaccination, hvor tidligere arbejde har vist manglen på immunrespons efter forskellige vaccinationsprogrammer og vores eget arbejde med EndoCAb-respons på monovalent tyfusvaccination. Denne ikke/dårlige reaktionsevne i disse undersøgelser ligger et sted mellem 10 og 40%. Diagrammet illustrerer andelen af ​​ikke-respondere (dvs. dårlig immunrespons), hvis de er ligeligt fordelt.