Perfiles de citoquinas y células secretoras de anticuerpos en recién nacidos en ECMO

Objetivos Específicos Objetivo Primario

1. Determinar el aumento, el pico y la caída de las ASC específicas del isotipo de inmunoglobulina y las proteínas inmunoactivas (citocinas y quimiocinas) a partir de muestras secuenciales de sangre periférica de lactantes en ECMO.

Objetivos secundarios:

1. Determine el momento más apropiado para tomar muestras de sangre de bebés con sospecha de sepsis para el ensayo de diagnóstico de ASC.
2. Caracterizar la incidencia de sepsis con cultivo negativo que conduce a ECMO.
3. Determinar los niveles específicos de isotipo de inmunoglobulina de ASC en lactantes con y sin infección.
4. Establezca un archivo de células mononucleares y plasma para usar en el desarrollo de ensayos ASC específicos de patógenos.

Hipótesis Los bebés en ECMO tendrán una respuesta ASC alta y patrones únicos de citoquinas/quimioquinas debido a una posible infección subyacente y exposición a muchos antígenos extraños (productos sanguíneos, circuito ECMO). Una parte significativa de estos tendrán ASC con especificidad para causas comunes de sepsis neonatal que no se detectan mediante hemocultivos de rutina.

Procedimientos:

Las muestras residuales se recolectarán de aquellas utilizadas en los procedimientos de rutina para bebés en ECMO. El volumen/muestra aproximado será de 0,5-0,8 ml. Las muestras se procesarán utilizando métodos bien establecidos en nuestro laboratorio. Brevemente, las PBMC se aislarán a través de un gradiente de Ficoll y se archivarán en nitrógeno líquido a -80 °C. El análisis por lotes de los niveles de ASC y la actividad de proliferación de linfocitos se realizará cuando se acumule una cantidad suficiente de muestras. Se determinará un perfil detallado y la cuantificación de las células inmunitarias mediante la tinción con clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) para CD3, CD4, CD8, CD27, CD38, CD45 y HLA-DR. Se utilizará un microarreglo de perlas para detectar los niveles de moléculas inmunoactivas, también realizado en el FACS. Las proteínas detectadas incluirán, entre otras, las siguientes: IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12p70, IL13, IL17, GCSF, GMCSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1β, TNFα. El procedimiento ASC será el establecido por Van de Verg modificado para usar placas de microcultivo de superficie de membrana en lugar de agar con resultados leídos por el analizador CTL en lugar del recuento manual. Los ensayos de LPA utilizarán técnicas establecidas desde hace mucho tiempo.