Profile von Antikörper-sekretierenden Zellen und Zyotokinen bei Neugeborenen auf ECMO

Spezifische Ziele Primäres Ziel

1. Bestimmen Sie den Anstieg, Peak und Abfall von Immunglobulin-Isotyp-spezifischen ASCs und immunaktiven Proteinen (Zytokinen und Chemokinen) aus aufeinanderfolgenden Proben von peripherem Blut von Säuglingen unter ECMO.

Sekundäre Ziele:

1. Bestimmen Sie den am besten geeigneten Zeitpunkt für die Blutentnahme von Säuglingen mit Verdacht auf Sepsis für den ASC-Diagnosetest.
2. Charakterisieren Sie das Auftreten von kulturnegativer Sepsis, die zu ECMO führt.
3. Bestimmen Sie die Immunglobulin-Isotyp-spezifischen ASC-Spiegel bei Säuglingen mit und ohne Infektion.
4. Einrichtung eines Archivs von mononukleären Zellen und Plasma zur Verwendung bei der Entwicklung erregerspezifischer ASC-Assays.

Hypothese Säuglinge unter ECMO haben eine hohe ASC-Reaktion und einzigartige Zytokin-/Chemokinmuster aufgrund einer möglichen zugrunde liegenden Infektion und Exposition gegenüber vielen fremden Antigenen (Blutprodukte, ECMO-Kreislauf). Ein erheblicher Teil davon wird ASCs mit Spezifität für häufige Ursachen von neonataler Sepsis aufweisen, die nicht durch routinemäßige Blutkulturen nachgewiesen werden.

Verfahren:

Restproben werden von denen gesammelt, die in Routineverfahren für Säuglinge mit ECMO verwendet werden. Das ungefähre Volumen/Probe beträgt 0,5–0,8 ml. Die Proben werden mit in unserem Labor etablierten Methoden verarbeitet. Kurz gesagt werden PBMCs über einen Ficoll-Gradienten isoliert und in flüssigem Stickstoff bei –80°C archiviert. Eine Chargenanalyse der ASC-Spiegel und der Lymphozytenproliferationsaktivität wird durchgeführt, wenn eine ausreichende Anzahl von Proben angesammelt ist. Ein detailliertes Profil und eine Quantifizierung der Immunzellen werden durch Färbung mit fluoreszierend aktiviertem Zellsortierer (FACS) für CD3, CD4, CD8, CD27, CD38, CD45 und HLA-DR bestimmt. Ein Kügelchen-Mikroarray wird verwendet, um die Konzentrationen von immunaktiven Molekülen nachzuweisen, was ebenfalls mit dem FACS durchgeführt wird. Die nachgewiesenen Proteine ​​beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12p70, IL13, IL17, GCSF, GMCSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1β, TNFα. Das ASC-Verfahren ist das von Van de Verg etablierte, modifiziert zur Verwendung von Mikrokulturplatten mit Membranoberfläche anstelle von Agar, wobei die Ergebnisse von einem CTL-Analysator anstelle einer manuellen Zählung abgelesen werden. LPA-Assays werden seit langem etablierte Techniken verwenden.