Vías moleculares implicadas en la patogenia y el comportamiento de los tumores fosfatúricos mesenquimales causantes de osteomalacia oncogénica

Protocolo de estudio Cultivo celular Se obtendrán muestras de médula ósea y tejido de los pacientes después de que hayan dado su consentimiento informado por escrito. El material se mantendrá en medio de cultivo RPMI (Sigma, R0883, Alemania). Se utilizarán células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos como control. Para la detección de células cancerosas en nuestras muestras, realizamos citometría de flujo utilizando perlas magnéticas EpCAM (39-EPC-50; Gentaur), y las células de selección negativa (no cancerosas) se aíslan y luego se cultivan en un matraz de 25 cm2 (5520100; Orange Scientific) con medio RPMI-1640 (R6504; Sigma).

Análisis molecular El ARN se extrae de cultivos celulares usando el RNeasy Mini Kit (74105; Qiagen, Hilden; Alemania). El kit de síntesis de cDNA de iScript (1708891; Bio-Rad, CA; EE. UU.) se usa para la síntesis de cDNA y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real se realiza con iTaq Universal SYBR Green Supermix (1725124; Bio-Rad). Los cebadores específicos para cada marcador y para un gen de control endógeno (ARNr 18S) se diseñan utilizando el software Genamic Expression 1.1. Se utilizará un ARN de referencia universal que consta de 10 líneas celulares de cáncer humano (740000-41; Agilent), así como ADN genómico humano (G304A; Promega) en reacciones de PCR cuantitativa (qPCR). Análisis estadístico Los resultados de qPCR se probarán de acuerdo con el prueba de Kolmogorov-Smirnov; Todas las reacciones (ensayos moleculares, citometría de flujo) se realizan por triplicado. Un valor de p <0,05 se considera significativo.