Vias Moleculares Envolvidas na Patogênese e Comportamento de Tumores Fosfatúricos Mesenquimais Causadores de Osteomalacia Oncogênica

Protocolo do estudo Cultura de células Amostras de medula óssea e tecido serão obtidas dos pacientes após eles darem seu consentimento informado por escrito. O material será mantido em meio de cultura RPMI (Sigma, R0883, Alemanha). Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis ​​serão utilizadas como controle. Para detecção de células cancerígenas em nossas amostras, realizamos citometria de fluxo usando esferas magnéticas EpCAM (39-EPC-50; Gentaur), e as células de seleção negativa (não cancerosas) são isoladas e depois cultivadas em frasco de 25 cm2 (5520100; Orange Scientific) com meio RPMI-1640 (R6504; Sigma).

Análise molecular O RNA é extraído de culturas celulares usando o RNeasy Mini Kit (74105; Qiagen, Hilden; Germany). O kit de síntese iScript cDNA (1708891; Bio-Rad, CA; EUA), é usado para síntese de cDNA e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, é realizado usando o iTaq Universal SYBR Green Supermix (1725124; Bio-Rad). Primers específicos para cada marcador e para um gene de controle endógeno (18S rRNA) são projetados usando o software Genamic Expression 1.1. Um RNA de referência universal composto por 10 linhas celulares de câncer humano (740000-41; Agilent) e DNA genômico humano (G304A; Promega) será usado em reações de PCR quantitativo (qPCR) Análise estatística Os resultados do qPCR serão testados de acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov; Todas as reações (ensaios moleculares, citometria de fluxo) são realizadas em triplicata. Um valor de p < 0,05 é considerado significativo.