Cambios en Resistome después de la extracción dental y amoxicilina.

Diseño del ensayo Se trata de un estudio de cohorte prospectivo, longitudinal y observacional que investiga a adultos jóvenes que se someten a la extracción quirúrgica de una muela del juicio con y sin antibióticos en el posoperatorio. La prescripción de antibióticos se basará en el juicio clínico basado en la complejidad del caso, el traumatismo y la duración del procedimiento. No se realizará ninguna aleatorización. Se llevarán a cabo cuatro puntos de tiempo de observación para recolectar 3 muestras bacterianas (muestra de saburra de la lengua, saliva y heces al inicio, 1 semana, 1 mes y 6 meses).

Estudiar el alcance y la persistencia de una variedad de genes de resistencia bacteriana dentro de la microbiota oral e intestinal de una cohorte de adultos jóvenes sistémicamente sanos antes y después de la extracción quirúrgica de terceros molares que reciben y no reciben amoxicilina.

Hipótesis Se prevé que un ciclo único de amoxicilina (250 mg tres veces al día durante cinco días) prescrito después de una extracción dental quirúrgica, como un tercer molar retenido, altera el perfil de resistencia a los antibióticos a corto y largo plazo y causa una reducción significativa cambio en la composición del resistoma oral e intestinal en una cohorte sana.

A partir del análisis de la resistencia bacteriana, la comparación de los datos de referencia a lo largo del tiempo dará una idea del impacto del aumento de la resistencia antibacteriana. La comprensión de esto debería ayudar a allanar el camino para determinar las pautas para la prescripción racional de antibióticos para los procedimientos clínicos quirúrgicos dentales y, por lo tanto, formar una base para la administración de antibióticos y determinar un riesgo potencial para la concienciación sobre los beneficios al prescribir antibióticos.

Se puede realizar un seguimiento de estos datos de referencia en un período de tiempo más prolongado para examinar la persistencia de los genes de resistencia a lo largo del tiempo en un estudio posterior. Se espera que un número significativo de pacientes provenga de cohortes de estudiantes en HKU, lo que facilitará la recuperación posterior. Se les pedirá a los pacientes que lleven un registro del consumo de antibióticos después del estudio inicial que puede informar investigaciones posteriores.

Se reclutarán sujetos programados para extracciones quirúrgicas que den su consentimiento por escrito para ser parte del estudio. Un operador clínico experimentado con formación especializada en cirugía maxilofacial (ML Co-A) será responsable de realizar el tratamiento clínico. La prescripción de antibióticos se basará en la complejidad del caso, la dificultad del procedimiento quirúrgico operatorio y el tiempo necesario. Por lo tanto, los pacientes no serán aleatorizados, sino basados ​​en la obtención de 10 pacientes en cada grupo. Se recolectarán tres conjuntos de muestras (saliva, raspados del dorso de la lengua y muestras de heces) en los siguientes cuatro momentos.

Se les pedirá a los sujetos que se abstengan de cepillarse los dientes la noche anterior a la recolección de muestras y se les pedirá de manera similar que no usen enjuagues bucales dentales. Además de los puntos de tiempo de recolección, se les pedirá a los sujetos que mantengan sus procedimientos de higiene bucal de rutina "normales" durante la duración del estudio.

Después de la recolección de las muestras de referencia, se realizará la extracción quirúrgica del tercer molar. El sujeto recibirá instrucciones posteriores a la extracción y analgésicos para el alivio del dolor para todos los sujetos y amoxicilina para aquellos que requieran antibióticos. El cumplimiento se verificará preguntándole al paciente y revisando las tiras de envoltura de la tableta de amoxicilina en las citas de revisión. Se le pedirá al sujeto que se abstenga de usar cualquier enjuague bucal durante el período de estudio de seis meses (si aún no lo ha hecho) y se le proporcionará una pasta de dientes sin contenido antibacteriano para su uso.

Las muestras de saburra de la lengua, saliva y heces para la extracción de ADN se recolectarán en todos los puntos de tiempo especificados como se describe a continuación.

Línea de base: grupo de antibióticos El día de la cirugía Línea de base: ningún antibiótico El día de la cirugía

1 semana

1 semana

1 mes 6 meses

Las muestras de la cavidad oral se tomarán por la mañana al menos dos horas después de las comidas. Se aconsejará a los sujetos que recolecten las muestras de heces dentro de las 24 horas posteriores a la cita programada.

Se usará un microcepillo estéril para recolectar las capas de la lengua. La muestra de la capa de la lengua se tomará después de frotar la superficie de la lengua tres veces desde atrás hacia adelante en la mitad de los dos tercios anteriores de la lengua para cada momento del muestreo. Después de la recolección de la muestra, se cortará la punta del microcepillo y se colocará dentro de un vial Eppendorf. Las muestras se almacenarán a -800C hasta que se realice la extracción de ADN.

Para las muestras de saliva, se le pedirá al sujeto que escupa en un recipiente estéril que se transferirá inmediatamente a hielo y luego se almacenará a -800C. La recolección de las muestras de heces se realizará de acuerdo con las pautas para la recolección de muestras de heces proporcionadas por el proyecto del microbioma humano (16). La extracción de ADN se realizará a partir de las muestras utilizando el kit de extracción de ADN proporcionado por (Qiagen, EE. UU.).

Secuenciación de escopeta metagenómica Para la secuenciación metagenómica, el ADN genómico extraído se cortará físicamente a un tamaño de fragmento promedio de 250 pb. El gDNA fragmentado se secuenciará bidireccionalmente (100 pb en cada dirección) en un carril de Illumina HighSeq. El filtrado de calidad se realizará con Trimmomatic (17), después de lo cual se combinarán las lecturas directas emparejadas y no emparejadas y se eliminarán las lecturas con más del 10 % de bases ambiguas. A continuación, las lecturas se examinarán en busca de secuencias humanas con Best Match Tagger v3.101 (18), después de lo cual se eliminarán las lecturas humanas y las lecturas duplicadas.

Abundancia relativa de genes resistentes El cebador blaTEM utilizado será el descrito por Kim et al (22). Los cebadores para analizar la presencia de genes de resistencia erm (G), erm (B) y erm (F) serán los descritos por Jansonn et al (23). Los cebadores para los genes Tet (M) y Tet (W) serán los descritos por Diaz-Torez et al (24). Los cebadores universales 16S se utilizarán para la cuantificación relativa como estándar.

12 La abundancia relativa de genes se evaluará mediante PCR en tiempo real. Las reacciones de PCR convencionales se utilizarán para generar amplicones específicos de genes que se utilizarán como estándares de ADN molde para qPCR. Los amplicones se purificarán con un kit de extracción de gel/PCR QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, EE. UU.) y se cuantificarán fluorométricamente con un kit de ensayo Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA (Invitrogen). El número de moléculas de ADN se calculará en función del tamaño y la masa de los amplicones. Se prepararán y utilizarán diluciones en serie diez veces mayores de los amplicones siguiendo el procedimiento de Yu et al. (25).

Selección y retiro de sujetos Los pacientes serán reclutados de la lista de espera del Hospital Dental Prince Philip de la Universidad de Hong Kong que hayan sido evaluados clínicamente y deseen que se les extraigan las muelas del juicio impactadas.

Tamaño de la muestra Presentaríamos el resultado en una escala log 10 en comparación con el día 0 en el ADN comunitario extraído de muestras fecales. Del estudio anterior (15), anticipamos la desviación estándar como 1,25 unidades. Mediante la determinación del tamaño de la muestra con el uso del software G*Power versión 3.1.9.2 (Franz Faul, Universitat Kiel, Alemania), necesitaríamos al menos 8 por grupo para tener una potencia de 0,8 para detectar la diferencia de 1,25 unidades en el 0,05 Nivel significativo. Por lo tanto, en esta investigación, recolectamos un tamaño de muestra total de 16 (8 por grupo) en la etapa inicial.

Tratamiento de los sujetos Este es un estudio de cohorte prospectivo, longitudinal y observacional que investiga a adultos jóvenes que se someten a la extracción quirúrgica de una muela del juicio con y sin antibióticos después de la operación. Se administrarán antibióticos y analgésicos después de la operación.

Amoxicilina Intraoral, tres veces al día 250 mg por 5 días Analgésicos - Arcoxia 120 mg por tres días y Paracetamol 500 mg QID PRN por 3 días o Paracetamol 1 g Más 16 mg de Fosfato de Codeína. La prescripción de antibióticos se basará en el juicio clínico basado en la complejidad del caso, el traumatismo y la duración del procedimiento. No se realizará ninguna aleatorización. Se llevarán a cabo cuatro puntos de tiempo de observación para recolectar 3 muestras bacterianas (saber de lengua, enjuague bucal y muestra de heces en: línea de base, 1 semana, 1 mes y 6 meses).

Si los pacientes tienen que tomar antibióticos adicionales en el período de revisión de seis meses, se les pedirá que informen al investigador.

El cumplimiento se verificará preguntándole al paciente y revisando las tiras de envoltura de la tableta de amoxicilina en las citas de revisión.

Evaluación de la eficacia El estudio no analiza la eficacia de un nuevo fármaco. Los procedimientos de tratamiento que se llevan a cabo están de acuerdo con el protocolo de tratamiento convencional.

Evaluación de la seguridad El estudio no analiza la seguridad de un nuevo fármaco. Los procedimientos de tratamiento que se llevan a cabo están de acuerdo con el protocolo de tratamiento convencional.