Изменения резистома после удаления зубов и амоксициллина.

Дизайн исследования Это проспективное лонгитюдное обсервационное когортное исследование, в котором изучались молодые люди, перенесшие хирургическое удаление зуба мудрости с применением антибиотиков и без них в послеоперационном периоде. Назначение антибиотиков будет основываться на клинической оценке, основанной на сложности случая, травме и продолжительности процедуры. Рандомизация производиться не будет. Для сбора 3 бактериальных образцов (налет с языка, образец слюны и кала) будут проведены четыре временных периода наблюдения: исходный уровень, 1 неделя, 1 месяц и 6 месяцев.

Изучить степень и персистенцию ряда генов устойчивости к бактериям в микробиоте полости рта и кишечника у когорты системно здоровых молодых людей до и после хирургического удаления третьих моляров, которые получают и не получают амоксициллин.

Гипотеза Ожидается, что однократный курс амоксициллина (250 мг три раза в день в течение пяти дней), назначаемый после хирургического удаления зуба, например ретинированного третьего моляра, изменяет профиль краткосрочной и долгосрочной устойчивости к антибиотикам и вызывает значительное сдвиг в составе ротового и кишечного резистома у здоровой когорты.

Анализ бактериальной резистентности, сравнение исходных данных с течением времени даст представление о влиянии повышенной антибактериальной резистентности. Понимание этого должно помочь проложить путь к разработке рекомендаций по рациональному назначению антибиотиков при стоматологических хирургических клинических процедурах и, таким образом, сформировать основу для рационального использования антибиотиков, а также определить потенциальный риск для повышения осведомленности при назначении антибиотиков.

Эти исходные данные можно отслеживать в течение более длительного периода времени, чтобы изучить устойчивость генов устойчивости с течением времени в более позднем исследовании. Ожидается, что значительное число пациентов будет из студенческих групп HKU, что облегчит отзыв пациентов в дальнейшем. Пациентов попросят вести журнал учета потребления антибиотиков после первоначального исследования, которое может быть использовано в последующих исследованиях.

Субъекты, запланированные для хирургического удаления, которые дадут письменное согласие на участие в исследовании, будут набраны. За выполнение клинического лечения будет отвечать опытный клинический оператор со специальной подготовкой по челюстно-лицевой хирургии (ML Co-A). Назначение антибиотиков будет основываться на сложности случая, сложности оперативного хирургического вмешательства и затраченного времени. Поэтому пациенты не будут рандомизированы, а будут основаны на получении 10 пациентов в каждой группе. Три набора образцов (слюна, соскоб со спинки языка и образцы кала) будут собраны в следующие четыре временных интервала.

Субъектов попросят воздержаться от чистки зубов в ночь перед сбором образцов и аналогичным образом попросят не пользоваться ополаскивателями для зубов. Помимо временных точек сбора, субъектов попросят поддерживать свои «нормальные» обычные процедуры гигиены полости рта на протяжении всего исследования.

После сбора исходных образцов будет проведено хирургическое удаление третьего моляра. Субъекту будут даны инструкции после экстракции и анальгетики для облегчения боли для всех субъектов и амоксициллин для тех, кому требуются антибиотики. Соблюдение режима будет проверено путем опроса пациента и проверки полосок, обертывающих таблетки амоксициллина, во время повторных приемов. Субъекту будет предложено воздержаться от использования какого-либо ополаскивателя для рта в течение шестимесячного периода исследования (если он еще этого не сделал), и для использования будет предоставлена ​​зубная паста без антибактериального содержания.

Образцы налета с языка, слюны и стула для выделения ДНК будут собираться во все указанные моменты времени, как описано ниже.

Исходный уровень – группа антибиотиков В день операции Исходный уровень – отсутствие антибиотиков В день операции

1 неделя

1 неделя

1 месяц 6 месяцев

Пробы из полости рта берут утром не позднее, чем через два часа после еды. Субъектам будет рекомендовано собрать образцы стула в течение 24 часов до запланированной встречи.

Стерильная микрощетка будет использоваться для сбора покрытий языка. Образец покрытия языка будет взят после трехкратного поглаживания поверхности языка от задней к передней стороне на одной половине передних двух третей языка для каждого момент времени отбора проб. После сбора образца кончик микрощетки будет обрезан и помещен во флакон Eppendorf. Образцы будут храниться при температуре -80°С до тех пор, пока не будет проведена экстракция ДНК.

Для образцов слюны испытуемому будет предложено сплюнуть в стерильный контейнер, который будет немедленно помещен в лед, а затем храниться при температуре -80°C. Сбор образцов стула будет осуществляться на основе рекомендаций по сбору образцов стула, данных для проекта микробиома человека (16). Выделение ДНК будет проводиться из образцов с использованием набора для выделения ДНК, предоставленного (Qiagen, США).

Метагеномное секвенирование дробовиком Для метагеномного секвенирования выделенная геномная ДНК будет физически разрезана до среднего размера фрагмента 250 п.н. Фрагментированную гДНК секвенируют двунаправленно (по 100 п.н. в каждом направлении) на дорожке Illumina HighSeq. Фильтрация по качеству будет выполнена с помощью Trimmomatic (17), после чего парные и непарные прямые чтения будут объединены, а чтения с более чем 10% неоднозначных оснований будут удалены. Затем чтения будут проверены на человеческие последовательности с помощью Best Match Tagger v3.101 (18), после чего человеческие чтения и повторяющиеся чтения будут удалены.

Относительное количество устойчивых генов. Используемый праймер blaTEM будет таким, как описано Kim et al (22). Праймеры для анализа наличия генов устойчивости к erm (G), erm (B) и erm (F) будут такими, как описано Jansonn et al. (23). Праймеры для генов Tet (M) и Tet (W) будут такими, как описано у Diaz-Torez et al (24). Универсальные праймеры 16S будут использоваться для относительного количественного определения в качестве стандарта.

12 Относительная распространенность генов будет оцениваться с помощью ПЦР в реальном времени. Обычные реакции ПЦР будут использоваться для создания специфических для гена ампликонов, используемых в качестве стандартов матричной ДНК для количественной ПЦР. Ампликоны очищают с использованием набора для выделения из геля/ПЦР QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, США) и количественно определяют флуорометрически с использованием набора для анализа дцДНК Quant-iTTM PicoGreen® (Invitrogen). Количество молекул ДНК будет рассчитано исходя из размера и массы ампликонов. Десятикратные серийные разведения ампликонов будут приготовлены и использованы в соответствии с процедурой Yu et al. (25).

Отбор и отзыв пациентов. Пациенты будут набраны из списка ожидания Стоматологической больницы принца Филиппа Университета Гонконга, которые прошли клиническое обследование и желают удалить ретенированные зубы мудрости.

Размер выборки Мы представили результат в логарифмической шкале 10 по сравнению с днем ​​0 для ДНК сообщества, извлеченной из образцов фекалий. Из предыдущего исследования (15) мы ожидаем, что стандартное отклонение составит 1,25 единицы. При определении размера выборки с использованием программного обеспечения G*Power версии 3.1.9.2 (Franz Faul, Universitat Kiel, Germany) нам потребуется не менее 8 человек на группу, чтобы иметь мощность 0,8 для обнаружения разницы в 1,25 единицы при 0,05. уровень значимости. Поэтому в этом исследовании мы собираем общий размер выборки как 16 (8 на группу) на начальном этапе.

Лечение субъектов Это проспективное продольное обсервационное когортное исследование, в котором изучались молодые люди, перенесшие хирургическое удаление зуба мудрости с применением антибиотиков и без них в послеоперационном периоде. После операции назначают антибиотики и анальгетики.

Амоксициллин Внутрь, 3 раза в день по 250 мг в течение 5 дней Анальгетики - Аркоксиа 120 мг в течение трех дней и Парацетамол 500 мг четыре раза в день PRN в течение 3 дней или Парацетамол 1 г плюс 16 мг кодеина фосфата. Назначение антибиотиков будет основываться на клинической оценке, основанной на сложности случая, травме и продолжительности процедуры. Рандомизация 14 не проводится. Для сбора 3 бактериальных образцов (налет с языка, ополаскиватель для рта и образец стула) будут проведены четыре временные точки наблюдения: исходный уровень, 1 неделя, 1 месяц и 6 месяцев.

Если пациенты должны будут принимать дополнительные антибиотики в течение периода обзора в шесть месяцев, их попросят сообщить об этом исследователю.

Соблюдение режима будет проверено путем опроса пациента и проверки полосок, обертывающих таблетки амоксициллина, во время повторных приемов.

Оценка эффективности В исследовании не рассматривается эффективность нового лекарственного средства. Лечебные процедуры проводятся в соответствии с общепринятым протоколом лечения.

Оценка безопасности Исследование не рассматривает безопасность нового препарата. Лечебные процедуры проводятся в соответствии с общепринятым протоколом лечения.