Zmiany w rezystomie po ekstrakcji zęba i amoksycylinie.

Projekt badania Jest to prospektywne, podłużne, obserwacyjne, kohortowe badanie młodych dorosłych poddawanych chirurgicznej ekstrakcji zęba mądrości z antybiotykami i bez antybiotyków po operacji. Recepta antybiotyków będzie oparta na ocenie klinicznej na podstawie złożoności przypadku, urazu i długości procedury. Żadna randomizacja nie zostanie przeprowadzona. W celu zebrania 3 próbek bakteryjnych (nalot na języku, próbka śliny i kału): punkt wyjściowy, 1 tydzień, 1 miesiąc i 6 miesięcy zostaną podjęte cztery obserwacyjne punkty czasowe.

Zbadanie zakresu i utrzymywania się szeregu genów oporności bakteryjnej w mikroflorze jamy ustnej i jelit kohorty zdrowych ogólnoustrojowo młodych dorosłych przed i po chirurgicznym usunięciu trzecich zębów trzonowych, którzy otrzymują i nie otrzymują amoksycyliny.

Hipoteza Przewiduje się, że pojedyncza dawka amoksycyliny (250 mg trzy razy na dobę przez pięć dni) przepisana po chirurgicznym usunięciu zęba, takiego jak zatrzymany trzeci trzonowiec, zmienia krótko- i długoterminowy profil oporności na antybiotyki i powoduje znaczną zmiana składu oporności jamy ustnej i jelit w zdrowej kohorcie.

Na podstawie analizy oporności bakterii porównanie z danymi wyjściowymi w czasie da wgląd w wpływ zwiększonej oporności na środki przeciwbakteryjne. Zrozumienie tego powinno pomóc utorować drogę do określenia wytycznych dotyczących racjonalnego przepisywania antybiotyków w stomatologicznych zabiegach chirurgicznych, a tym samym stworzyć podstawę do zarządzania antybiotykami, a także określić potencjalne ryzyko dla świadomości korzyści podczas przepisywania antybiotyków.

Te podstawowe dane można śledzić w dłuższych ramach czasowych, aby zbadać trwałość genów oporności w czasie w późniejszym badaniu. Oczekuje się, że znaczna liczba pacjentów będzie pochodzić z kohort studentów w HKU, co ułatwi późniejsze przywoływanie. Pacjenci zostaną poproszeni o prowadzenie dziennika zużycia antybiotyków po wstępnym badaniu, który może posłużyć jako materiał do późniejszych badań.

Zrekrutowani zostaną pacjenci zakwalifikowani do ekstrakcji chirurgicznych, którzy wyrażą pisemną zgodę na udział w badaniu. Za wykonanie leczenia klinicznego odpowiedzialny będzie doświadczony operator kliniczny ze specjalistycznym szkoleniem z chirurgii szczękowo-twarzowej (ML Co-A). Recepta antybiotyków będzie oparta na złożoności przypadku, trudności zabiegu operacyjnego i czasie trwania. Dlatego pacjenci nie będą randomizowani, ale w oparciu o uzyskanie 10 pacjentów w każdej grupie. Trzy zestawy próbek (ślina, zeskrobiny z grzbietu języka i próbki kału) zostaną zebrane w następujących czterech punktach czasowych.

Osoby badane zostaną poproszone o powstrzymanie się od mycia zębów w noc poprzedzającą pobranie próbki i podobnie poproszone o niestosowanie płynów do płukania jamy ustnej. Poza punktami czasowymi pobierania próbek, uczestnicy zostaną poproszeni o zachowanie „normalnych”, rutynowych procedur higieny jamy ustnej przez cały czas trwania badania.

Po pobraniu próbek wyjściowych zostanie przeprowadzona chirurgiczna ekstrakcja trzeciego zęba trzonowego. Pacjent otrzyma instrukcje po ekstrakcji i środki przeciwbólowe w celu złagodzenia bólu dla wszystkich pacjentów oraz amoksycylinę dla tych, którzy wymagają antybiotyków. Zgodność zostanie sprawdzona, pytając pacjenta i sprawdzając paski opakowania tabletki amoksycyliny podczas wizyt kontrolnych. Badany zostanie poproszony o powstrzymanie się od płukania jamy ustnej podczas sześciomiesięcznego okresu badania (jeśli jeszcze tego nie zrobił), a do użytku zostanie mu dostarczona pasta do zębów bez zawartości antybakteryjnej.

Nalot na języku, próbki śliny i kału do ekstrakcji DNA będą pobierane we wszystkich określonych punktach czasowych, jak opisano poniżej.

Wartość wyjściowa – grupa antybiotykowa W dniu operacji Wartość wyjściowa – brak antybiotyku W dniu operacji

1 tydzień

1 tydzień

1 miesiąc 6 miesięcy

Próbki z jamy ustnej będą pobierane rano, co najmniej dwie godziny po posiłku. Pacjenci zostaną poproszeni o pobranie próbek kału w ciągu 24 godzin od zaplanowanej wizyty.

Do pobrania powłoki z języka zostanie użyta sterylna mikroszczoteczka Próbka powłoki z języka zostanie pobrana po trzykrotnym przetarciu powierzchni języka od tyłu do przodu na połowie przednich dwóch trzecich języka dla każdego punkt czasowy pobierania próbek. Po pobraniu próbki końcówka mikroszczoteczki zostanie odcięta i umieszczona w fiolce Eppendorfa. Próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji DNA.

W przypadku próbek śliny badany zostanie poproszony o wyplucie do sterylnego pojemnika, który zostanie natychmiast przeniesiony do lodu, a następnie przechowywany w temperaturze -80°C. Pobieranie próbek kału zostanie przeprowadzone w oparciu o wytyczne dotyczące pobierania próbek kału podane dla projektu Human Microbiome (16). Ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona z próbek przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA dostarczonego przez (Qiagen, USA).

Metagenomiczne sekwencjonowanie shotgun W przypadku sekwencjonowania metagenomicznego wyekstrahowany genomowy DNA zostanie fizycznie pocięty do fragmentów o średniej wielkości 250 bp. Pofragmentowany gDNA będzie sekwencjonowany dwukierunkowo (100 bp w każdym kierunku) na ścieżce Illumina HighSeq. Filtrowanie jakości zostanie przeprowadzone za pomocą Trimmomatic (17), po czym sparowane i niesparowane odczyty do przodu zostaną połączone, a odczyty zawierające więcej niż 10% niejednoznacznych zasad zostaną usunięte. Następnie odczyty zostaną sprawdzone pod kątem sekwencji ludzkich za pomocą Best Match Tagger v3.101 (18), po czym odczyty ludzkie i zduplikowane odczyty zostaną usunięte.

Względna obfitość genów oporności Zastosowany starter blaTEM będzie taki, jak opisali Kim i wsp. (22). Startery do analizy obecności genów oporności erm (G), erm (B) i erm (F) będą takie, jak opisali Jansonn i wsp. (23). Startery dla genów Tet (M) i Tet (W) będą takie, jak opisali Diaz-Torez i wsp. (24). Uniwersalne startery 16S będą stosowane jako wzorzec do względnej oceny ilościowej.

12 Względna obfitość genów zostanie oceniona za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Konwencjonalne reakcje PCR zostaną wykorzystane do wygenerowania amplikonów specyficznych dla genów, które będą używane jako wzorce matrycy DNA dla qPCR. Amplikony zostaną oczyszczone przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej/PCR QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA) i ocenione ilościowo fluorometrycznie przy użyciu zestawu Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen). Liczba cząsteczek DNA zostanie obliczona na podstawie wielkości i masy amplikonów. Dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia amplikonów zostaną przygotowane i użyte zgodnie z procedurą Yu i in. (25).

Wybór i wycofanie pacjentów Pacjenci będą rekrutowani z listy oczekujących ze Szpitala Stomatologicznego im. Księcia Filipa na Uniwersytecie w Hongkongu, którzy przeszli badania kliniczne i chcą usunąć zatrzymane zęby mądrości.

Wielkość próbki Przedstawilibyśmy wynik w skali logarytmicznej 10 w porównaniu z dniem 0 w DNA społeczności wyekstrahowanym z próbek kału. Na podstawie poprzedniego badania (15) przewidujemy, że odchylenie standardowe wyniesie 1,25 jednostki. Przy określaniu wielkości próby za pomocą oprogramowania G*Power w wersji 3.1.9.2 (Franz Faul, Universitat Kiel, Niemcy) potrzebowalibyśmy co najmniej 8 na grupę, aby mieć moc 0,8, aby wykryć różnicę 1,25 jednostki przy 0,05 poziom istotności. Dlatego w tym badaniu zbieramy całkowitą wielkość próby jako 16 (8 na grupę) na początkowym etapie.

Leczenie pacjentów Jest to prospektywne, podłużne, obserwacyjne badanie kohortowe obejmujące młodych dorosłych poddawanych chirurgicznej ekstrakcji zęba mądrości z i bez antybiotyków po operacji. Antybiotyki i środki przeciwbólowe zostaną podane po operacji.

Amoksycylina Doustnie, trzy razy dziennie 250 mg przez 5 dni Leki przeciwbólowe - Arcoxia 120 mg przez trzy dni i Paracetamol 500 mg QID PRN przez 3 dni lub Paracetamol 1 g plus 16 mg fosforanu kodeiny. Recepta antybiotyków będzie oparta na ocenie klinicznej na podstawie złożoności przypadku, urazu i długości procedury. Nie zostanie przeprowadzona randomizacja nr 14. Zostaną podjęte cztery obserwacyjne punkty czasowe w celu zebrania 3 próbek bakteryjnych (nalot na języku, płukanie jamy ustnej i próbka kału w punkcie wyjściowym, 1 tygodniu, 1 miesiącu i 6 miesiącach.

Jeśli pacjenci będą musieli przyjmować dodatkowe antybiotyki w sześciomiesięcznym okresie przeglądu, zostaną poproszeni o poinformowanie o tym badacza.

Zgodność zostanie sprawdzona, pytając pacjenta i sprawdzając paski opakowania tabletki amoksycyliny podczas wizyt kontrolnych.

Ocena skuteczności Badanie nie dotyczy skuteczności nowego leku. Przeprowadzane procedury leczenia są zgodne z konwencjonalnym protokołem leczenia.

Ocena bezpieczeństwa Badanie nie dotyczy bezpieczeństwa nowego leku. Przeprowadzane procedury leczenia są zgodne z konwencjonalnym protokołem leczenia.