Eficacia de artesunato + amodiaquina frente a arteméter-lumefantrina para la malaria falciparum en Zanzíbar, 2005 (ACOII)

Todos los niños del grupo de edad adecuado que presentaban signos clínicos de paludismo en el sitio del estudio se consideraron posibles sujetos de estudio. Los tutores de estos niños fueron informados sobre el estudio oralmente en swahili de acuerdo con el formulario de consentimiento informado. Aquellos que no estaban dispuestos a participar en el estudio fueron tratados de acuerdo con el procedimiento estándar local.

El día 0, se analizó al paciente en busca de parásitos usando microscopía óptica en frotis de sangre teñidos con Giemsa. Se evaluó una historia clínica detallada y un examen clínico que incluyó una temperatura axilar. Se evaluó la hemoglobina y se recolectaron muestras de sangre en papel de filtro para cada niño para el genotipado de los parásitos, así como para la posible determinación de los niveles en sangre de diferentes medicamentos antipalúdicos.

Se le pidió al tutor que trajera a su hijo al sitio de estudio los días 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35 y 42. Si no lo hacían, se les visitaba en sus hogares para asegurar un seguimiento adecuado. En cada seguimiento, el investigador preguntó sobre la medicación concomitante y los eventos adversos, completando cuidadosamente el formulario de informe clínico (CRF).

Si, durante el seguimiento entre los días 14 y 42, un niño inscrito previamente en el estudio presentaba fiebre, todas las pruebas y exámenes se realizaban como en el día 0. Si el niño era clínica y parasitológicamente diagnosticado nuevamente con malaria, se le trataba como una nueva infección. Si se diagnosticaba paludismo grave durante el período de seguimiento, el paciente recibía tratamiento de rescate (quinina oral o intravenosa) y se retiraba del estudio. Cada vez que un niño inscrito se presentó en el sitio, se completó el CRF con respecto al estado clínico y de laboratorio, el tratamiento administrado y los posibles eventos adversos.

Las evaluaciones clínicas y de laboratorio incluyeron:

Frotis de malaria: Frotis gruesos de sangre teñidos con Giemsa examinados usando un microscopio eléctrico o de luz solar en el sitio de estudio por un microscopista experimentado. El número de parásitos se calculó como el número de parásitos observados frente a 200 leucocitos en la gota gruesa de sangre y se registró en el CRF para la ocasión correcta. Los portaobjetos se almacenaron para controles de calidad doble verificación (10% de todos los portaobjetos) de forma centralizada.

Hemoglobina: Los niveles de hemoglobina se midieron mediante el método HaemoCue™ utilizando muestras de sangre recogidas en cubetas. Los niveles de Hb se registraron en el CRF para cada ocasión.

Imagen de sangre completa (FBP) y prueba de función hepática (LFT): FBP y LFT se realizaron solo en la subpoblación del sitio de estudio de Kivunge (subestudio GLP). La FBP se obtuvo utilizando el analizador de hematología Cell-Dyn 1700™ (Abbott Laboratories, EE. UU.). La LFT, que incluye ALT, AST, Gamma-GT, albúmina y bilirrubina, se obtuvo con el fotómetro BTS-310™ UV-VIS (BioSystems, España).

Temperatura e historial clínico: un médico/oficial médico midió la temperatura axilar del paciente con un termómetro electrónico y tomó un historial clínico detallado y realizó un examen clínico.

Muestra de papel de filtro PCR: Las muestras de sangre se recogieron en papeles de filtro Whatman FTA. Una vez seco, cada muestra de papel de filtro se almacenó en bolsas de plástico separadas a -20 ºC (Kivunge) o +4 ºC (Micheweni) hasta que se transfirieron regularmente a Kivunge para almacenamiento a largo plazo a -20 ºC.

Muestras de HPLC (solo Kivunge): se extrajeron aproximadamente 5 ml de sangre venosa de cada paciente los días 0 y 7 para las pruebas FBP y LFT. En el grupo ASAQ, se recogieron 100 µl de esta sangre en papeles de filtro especiales para el análisis de los niveles de amodiaquina mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En el grupo AL, se recogieron 100 µl de plasma (separados por centrifugación a >3000 rpm durante 10 min) en papeles de filtro especiales para el análisis HPLC de los niveles de lumefantrina. Se recogió todo el resto (mínimo 2 ml) de plasma y se mantuvo a -20ºC como respaldo.

Análisis moleculares: se realizó el genotipado por PCR de la proteína 2 de la superficie del merozoíto (msp2), considerado el marcador genético individual más informativo para la multiplicidad de infecciones por P. falciparum, para diferenciar las reinfecciones de la verdadera recrudescencia. Los resultados de la PCR pareada se compararon entre el día 0 y el momento de la parasitemia recurrente desde el día 14 hasta el día 42. La región externa conservada del bloque repetitivo polimórfico 3 de msp2 se amplificó en una reacción inicial seguida de dos reacciones anidadas con cebadores de oligonucleótidos específicos para las dos familias alélicas FC27 e IC/3D7, usando un protocolo estándar. El análisis de las proteínas de nucleótido único (SNP) de los genes pfmdr1 Y86N y pfcrt K76T se realizó de acuerdo con los protocolos establecidos de PCR-RFLP basados ​​en la restricción AluI. Todos los análisis moleculares se realizaron en la Unidad de Investigación de Malaria, KI, Suecia.