Efficacia di Artesunate + Amodiaquine Versus Artemether-lumefantrine per Falciparum Malaria a Zanzibar, 2005 (ACOII)

Tutti i bambini nella giusta fascia di età che presentavano segni clinici di malaria nel sito dello studio sono stati considerati possibili soggetti dello studio. I tutori di questi bambini sono stati informati dello studio oralmente in swahili secondo il modulo di consenso informato. Coloro che non erano disposti a partecipare allo studio sono stati trattati secondo la procedura standard locale.

Il giorno 0 il paziente è stato testato per i parassiti utilizzando la microscopia ottica su strisci di sangue colorato con Giemsa. È stata valutata una storia clinica dettagliata e un esame clinico che includeva una temperatura ascellare. L'emoglobina è stata valutata e sono stati raccolti campioni di sangue su carta da filtro per ogni bambino per la genotipizzazione dei parassiti e per l'eventuale determinazione dei livelli ematici di diversi farmaci antimalarici.

Al tutore è stato chiesto di riportare il bambino nel sito dello studio nei giorni 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42. Se non lo facevano, venivano visitati nelle loro case per assicurare un adeguato follow-up. Ad ogni follow-up lo sperimentatore ha chiesto informazioni sui farmaci concomitanti e sugli eventi avversi, compilando attentamente il modulo di segnalazione clinica (CRF).

Se durante il follow-up tra il giorno 14 e il giorno 42, un bambino precedentemente arruolato nello studio presentava febbre, tutti i test e gli esami venivano eseguiti come al giorno 0. Se al bambino veniva diagnosticata nuovamente la malaria dal punto di vista clinico e parassitologico, veniva curato come una nuova infezione. In caso di diagnosi di malaria grave durante il periodo di follow-up, al paziente è stato somministrato un trattamento di salvataggio (chinino orale o endovenoso) e ritirato dallo studio. Ogni volta che un bambino arruolato si presentava al centro, il CRF veniva completato per quanto riguarda lo stato clinico e di laboratorio, il trattamento somministrato e i possibili eventi avversi.

Le valutazioni cliniche e di laboratorio includevano:

Striscio di malaria: strisci di sangue denso macchiato di Giemsa esaminati utilizzando un microscopio elettrico o solare nel sito di studio da un microscopista esperto. Il numero di parassiti è stato calcolato come il numero di parassiti osservati contro 200 leucociti nello strato denso di sangue e registrato nel CRF per l'occasione corretta. I vetrini sono stati archiviati per i controlli di qualità a doppio controllo (10% di tutti i vetrini) centralmente.

Emoglobina: i livelli di emoglobina sono stati misurati con il metodo HaemoCue™ utilizzando campioni di sangue raccolti su cuvette. I livelli di Hb sono stati registrati nel CRF per ogni occasione.

Full Blood Picture (FBP) e test di funzionalità epatica (LFT): FBP e LFT sono stati eseguiti solo nella sottopopolazione del sito di studio Kivunge (studio secondario BPL). L'FBP è stato ottenuto utilizzando l'analizzatore ematologico Cell-Dyn 1700™ (Abbott Laboratories, USA). LFT, inclusi ALT, AST, Gamma-GT, albumina e bilirubina, è stato ottenuto utilizzando il fotometro UV-VIS BTS-310™ (BioSystems, Spagna).

Temperatura e storia clinica: un medico/ufficiale ha misurato la temperatura ascellare del paziente utilizzando un termometro elettronico e ha raccolto una storia clinica dettagliata ed eseguito un esame clinico.

Campione di carta da filtro per PCR: i campioni di sangue sono stati raccolti su carta da filtro Whatman FTA. Una volta asciutto, ciascun campione di carta da filtro è stato conservato in sacchetti di plastica separati a -20ºC (Kivunge) o +4ºC (Micheweni) fino al trasferimento regolare a Kivunge per la conservazione a lungo termine a -20ºC.

Campioni HPLC (solo Kivunge): sono stati prelevati circa 5 ml di sangue venoso da ciascun paziente nei giorni 0 e 7 per i test FBP e LFT. Nel gruppo ASAQ 100 µl di questo sangue sono stati raccolti su speciali carte da filtro per l'analisi HPLC (high pressure liquid chromatography) dei livelli di amodiachina. Nel gruppo AL 100 µl di plasma (separato mediante centrifugazione a >3000 rpm per 10 min) sono stati raccolti su speciali carte da filtro per l'analisi HPLC dei livelli di lumefantrina. Tutto il plasma rimanente (minimo 2 ml) è stato raccolto e conservato a -20ºC come riserva.

Analisi molecolari: la genotipizzazione PCR della proteina di superficie merozoita 2 (msp2), considerata il singolo marcatore genetico più informativo per la molteplicità delle infezioni da P. falciparum, è stata eseguita per differenziare le reinfezioni dalla vera recrudescenza. I risultati della PCR accoppiata sono stati confrontati tra il giorno 0 e al momento della parassitemia ricorrente dal giorno 14 fino al giorno 42. La regione esterna conservata del blocco ripetitivo polimorfico 3 di msp2 è stata amplificata in una reazione iniziale seguita da due reazioni nidificate con primer oligonucleotidici specifici per le due famiglie alleliche FC27 e IC/3D7, utilizzando un protocollo standard. L'analisi delle proteine ​​a singolo nucleotide (SNP) dei geni pfmdr1 Y86N e pfcrt K76T è stata eseguita secondo i protocolli PCR-RFLP basati sulla restrizione AluI stabiliti. Tutte le analisi molecolari sono state eseguite presso la Malaria Research Unit, KI, Svezia.