Tratamiento del prurito crónico en la dermatitis atópica con antagonista opioide naltrexona

Objetivos específicos:

A1 Evaluar el mecanismo subyacente de la gravedad del picor en términos de ritmo circadiano mediante la recolección de epidermis en diferentes etapas circadianas mediante ampollas de succión. Esto se hará en pacientes con EA con prurito crónico. Las células se aislarán de parte de las ampollas de succión y se usarán para aislar y secuenciar el ARN para evaluar y comparar la expresión diferencial de proteínas y ARN en ampollas de succión tomadas de áreas sintomáticas y no sintomáticas en pacientes con DA en diferentes momentos. Luego, los investigadores correlacionarán la gravedad de los síntomas de la picazón con los niveles del gen del reloj y del receptor opioide y el patrón diferencial de expresión del ARN. A1 será evaluado por el brazo de estudio A y los resultados de este estudio servirán para decidir el momento en que se tomarán las ampollas de succión para los estudios terapéuticos/mecanísticos (brazo B y C).

A2 Investigar el papel mecánico y la eficacia terapéutica de los receptores opioides en la picazón crónica. Para este propósito, se usará un diseño cruzado controlado con placebo para tratar a los pacientes con antagonistas de los receptores de opioides (naltrexona) ampliando nuestro ensayo existente. Los investigadores recopilarán, evaluarán, cuantificarán y compararán la expresión diferencial de proteína y ARN en la epidermis tomada por ampollas de succión de áreas sintomáticas y no sintomáticas en pacientes con DA en tratamiento con placebo o naltrexona. El análisis del transcriptoma se centrará, entre otros, en el análisis de marcadores neuroinflamatorios y neuronales (incluidas citoquinas, GPCR y receptores opioides). La confirmación se producirá mediante la hibridación in situ de las biopsias para correlacionar el tipo y la ubicación específicos de las células y la expresión qPCR de los cultivos in vitro. Se llevarán a cabo los estudios de unión utilizando ligandos opioides marcados con fluorescencia y el patrón de internalización.

A3 Probar los mecanismos subyacentes del sistema opioide con la interacción entre nervios y queratinocitos y los posibles efectos sobre la transducción del picor de la piel a los nervios mediante el uso de un modelo de cocultivo de neuronas y queratinocitos in vitro. Además, los investigadores planean validar las redes y vías que causan picazón que se encuentran en A2 utilizando este modelo in vitro y podrán evaluar los cambios en el umbral de flujo de calcio después de la exposición a estímulos externos (p. luz, o estímulos mecánicos) sobre queratinocitos y somas neuronales bajo diferentes condiciones de exposición a opioides. Las neuronas sensoriales derivadas de FC se cocultivarán con diferentes pacientes KC. Los investigadores probarán el patrón de reacción de KC y la transmisión de la señal a las neuronas sensoriales periféricas conectadas mediante imágenes y electrofisiología de Fluo-4 AM Calcium. La reacción responderá al odorante Sandalore, ya que los investigadores han publicado previamente que Sandalore induce estos flujos de calcio deseados.

Aplique el modelo epitelial/nervioso in vitro para validar posibles vías de picor identificadas por análisis epigenético en los ensayos clínicos mediante la confirmación del patrón de expresión con qPCR y ensayos funcionales en células con desactivación CRISPR de los objetivos de ARN, tráfico de opioides, imágenes de calcio y electrofisiología. Por último, siga desarrollando cocultivos entre la piel humana y las neuronas periféricas humanas derivadas de iPS para realizar estudios funcionales.