Tratamento da coceira crônica na dermatite atópica com o antagonista opioide naltrexona

Objetivos específicos:

A1 Avalie o mecanismo subjacente da gravidade da coceira em termos de ritmo circadiano, coletando a epiderme em diferentes estágios circadianos usando bolhas de sucção. Isso será feito em pacientes com DA com coceira crônica. As células serão isoladas de parte das bolhas de sucção e usadas para isolar e sequenciar RNA para avaliar e comparar a expressão diferencial de proteínas e RNA em bolhas de sucção retiradas de áreas sintomáticas e não sintomáticas em pacientes com DA em diferentes momentos. Os investigadores irão, então, correlacionar os sintomas da gravidade da coceira com os níveis do gene do relógio e do receptor opióide e o padrão diferencial de expressão do RNA. A1 será avaliado pelo braço de estudo A e os resultados deste estudo servirão para decidir sobre o momento da tomada das bolhas de sucção para os estudos terapêuticos/mecanísticos (braço B e C).

A2 Investigar o papel mecanicista e a eficácia terapêutica dos receptores opioides na coceira crônica. Para este propósito, um design cruzado controlado por placebo será usado para tratar pacientes com antagonista do receptor opióide (Naltrexone) expandindo nosso estudo existente. Os investigadores irão coletar, avaliar, quantificar e comparar a expressão diferencial de proteína e RNA na epiderme retirada por bolhas de sucção de áreas sintomáticas e não sintomáticas em pacientes com DA em tratamento com placebo ou naltrexona. A análise do transcriptoma será focada, mas não restrita à análise de marcadores neuroinflamatórios e neuronais (incluindo citocinas, GPCR e receptores opióides). A confirmação ocorrerá usando hibridização in situ de biópsias para correlacionar tipo e localização de células específicas e expressão qPCR de culturas in vitro. Serão realizados estudos de ligação utilizando ligantes opióides marcados com fluorescência e padrão de internalização.

A3 Testar os mecanismos subjacentes do sistema opióide com interação nervo-queratinócito e possíveis efeitos na transdução de coceira da pele para os nervos usando um modelo de co-cultura de neurônio-queratinócito in vitro. Além disso, os pesquisadores planejam validar as redes e vias causadoras de coceira encontradas em A2 usando este modelo in vitro e serão capazes de avaliar as mudanças no limiar do fluxo de cálcio após a exposição a estímulos externos (por exemplo, luz, ou estímulos mecânicos) em queratinócitos e somata neuronal sob diferentes condições de exposição a opioides. Os neurônios sensoriais derivados de FC serão co-cultivados com diferentes pacientes KC. Os investigadores testarão o padrão de reação de KC e a transmissão do sinal aos neurônios sensoriais periféricos conectados por imagens e eletrofisiologia de cálcio Fluo-4 AM. A reação estará respondendo ao odorante Sandalore, já que os investigadores publicaram anteriormente que Sandalore induz esses fluxos de cálcio desejados.

Aplique o modelo epitelial/nervoso in vitro para validar possíveis vias de coceira identificadas por análise epigenética nos ensaios clínicos, confirmando o padrão de expressão com qPCR e ensaios funcionais em células com nocaute CRISPR dos alvos de RNA, tráfico de opioides, imagens de cálcio e eletrofisiologia. Finalmente, desenvolver co-culturas entre a pele humana e neurônios periféricos humanos derivados de iPS para realizar estudos funcionais.