Trattamento del prurito cronico nella dermatite atopica con l'antagonista degli oppioidi Naltrexone

Obiettivi specifici:

A1 Valutare il meccanismo alla base della gravità del prurito in termini di ritmo circadiano raccogliendo l'epidermide in diversi stadi circadiani utilizzando bolle di aspirazione. Questo sarà fatto in pazienti con AD con prurito cronico. Le cellule saranno isolate da parte dei blister di aspirazione e utilizzate per isolare e sequenziare l'RNA per valutare e confrontare l'espressione differenziale di proteine ​​e RNA nel blister di aspirazione prelevato da aree sintomatiche e non sintomatiche in pazienti con AD in diversi momenti. Gli investigatori correleranno quindi i sintomi della gravità del prurito ai livelli del gene dell'orologio e del recettore degli oppioidi e al modello differenziale di espressione dell'RNA. A1 sarà valutato dal braccio di studio A e i risultati di questo studio serviranno per decidere il momento in cui prendere i blister di aspirazione per gli studi terapeutici/meccanicistici (braccio B e C).

A2 Indagare il ruolo meccanicistico e l'efficacia terapeutica dei recettori degli oppioidi nel prurito cronico. A tal fine, verrà utilizzato un disegno incrociato controllato con placebo per trattare i pazienti con antagonista del recettore degli oppioidi (Naltrexone) espandendo il nostro studio esistente. Gli investigatori raccoglieranno, valuteranno, quantificheranno e confronteranno l'espressione differenziale di proteine ​​e RNA nell'epidermide prelevata da vesciche di aspirazione da aree sintomatiche e non sintomatiche in pazienti con AD in trattamento con placebo o naltrexone. L'analisi del trascrittoma sarà focalizzata, ma non limitata a, sull'analisi di marcatori neuroinfiammatori e neuronali (incluse citochine, GPCR e recettori oppioidi). La conferma avverrà utilizzando l'ibridazione in situ delle biopsie per correlare il tipo e la posizione cellulare specifici e l'espressione qPCR delle colture in vitro. Saranno condotti gli studi di legame utilizzando ligandi oppioidi marcati con fluorescenza e pattern di internalizzazione.

A3 Testare i meccanismi alla base del sistema oppioide con l'interazione nervo-cheratinociti ei possibili effetti sulla trasduzione del prurito dalla pelle ai nervi utilizzando un modello di co-coltura neurone-cheratinocita in vitro. Inoltre, i ricercatori intendono convalidare le reti e i percorsi che causano prurito trovati in A2 utilizzando questo modello in vitro e saranno in grado di valutare i cambiamenti della soglia del flusso di calcio dopo l'esposizione a stimoli esterni (ad es. stimoli luminosi o meccanici) sui cheratinociti e sui corpi neuronali in diverse condizioni di esposizione agli oppioidi. I neuroni sensoriali derivati ​​dalla FC saranno co-coltivati ​​con diversi KC del paziente. Gli investigatori testeranno il modello di reazione di KC e la trasmissione del segnale ai neuroni sensoriali periferici collegati mediante imaging Fluo-4 AM Calcium ed elettrofisiologia. La reazione risponderà all'odore Sandalore, poiché i ricercatori hanno precedentemente pubblicato che Sandalore induce questi flussi di calcio desiderati.

Applicare il modello epiteliale/nervoso in vitro per convalidare i possibili percorsi di prurito identificati dall'analisi epigenetica negli studi clinici confermando il pattern di espressione con qPCR e saggi funzionali su cellule con knockout CRISPR degli obiettivi dell'RNA, traffico di oppioidi, imaging del calcio ed elettrofisiologia. Infine, sviluppare ulteriormente co-colture tra pelle umana e neuroni periferici umani derivati ​​da iPS per eseguire studi funzionali.