Léčba chronického svědění u atopické dermatitidy opioidním antagonistou naltrexonem

Konkrétní cíle:

A1 Vyhodnoťte základní mechanismus závažnosti svědění z hlediska cirkadiánního rytmu odběrem epidermis v různých cirkadiánních stádiích pomocí sacích puchýřků. To bude provedeno u pacientů s AD s chronickým svěděním. Buňky budou izolovány z části sacích blistrů a použity k izolaci a sekvenování RNA k vyhodnocení a porovnání rozdílné exprese proteinu a RNA v sacích blistrech odebraných ze symptomatických a nesymptomatických oblastí u pacientů s AD v různých časových bodech. Vyšetřovatelé pak korelují symptomy závažnosti svědění s hladinami hodinového genu a opioidního receptoru a rozdílným vzorem exprese RNA. A1 bude hodnocena ve studijním rameni A a výsledky z této studie poslouží k rozhodnutí o časovém bodu odběru sacích blistrů pro terapeutické/mechanické studie (rameno B a C).

A2 Zkoumejte mechanickou úlohu a terapeutickou účinnost opioidních receptorů u chronického svědění. Za tímto účelem bude k léčbě pacientů s antagonistou opioidních receptorů (naltrexon) použit zkřížený, placebem kontrolovaný design rozšířením naší stávající studie. Výzkumníci budou shromažďovat, hodnotit, kvantifikovat a porovnávat rozdílnou expresi proteinů a RNA v epidermis odebraných sacími puchýři ze symptomatických a nesymptomatických oblastí u pacientů s AD na léčbě placebem nebo naltrexonem. Analýza transkriptomu bude zaměřena, ale bez omezení, na analýzu neurozánětlivých a neuronálních markerů (včetně cytokinů, GPCR a opioidních receptorů). Potvrzení proběhne pomocí in-situ hybridizace biopsií ke korelaci specifického buněčného typu a umístění a qPCR exprese in vitro kultur. Budou provedeny vazebné studie s použitím fluorescenčně značených opioidních ligandů a internalizačního vzoru.

A3 Testujte základní mechanismy opioidního systému s interakcí nerv-keratinocyty a možné účinky na transdukci svědění z kůže do nervů pomocí in vitro modelu společné kultury neuron-keratinocyt. Kromě toho vědci plánují ověřit sítě a dráhy způsobující svědění nalezené v A2 pomocí tohoto in vitro modelu a budou schopni vyhodnotit změny prahu toku vápníku po expozici vnějším stimulům (např. světlo nebo mechanické podněty) na keratinocyty a neuronální somata za různých podmínek expozice opioidům. Senzorické neurony odvozené z FC budou kokultivovány s různými pacientskými KC. Vyšetřovatelé budou testovat reakční vzorec KC a přenos signálu do připojených periferních senzorických neuronů pomocí zobrazování a elektrofyziologie Fluo-4 AM Calcium. Reakce bude reagovat na odorant Sandalore, protože vyšetřovatelé již dříve publikovali, že Sandalore vyvolává tyto žádoucí toky vápníku.

Aplikujte in vitro epiteliální/nervový model k ověření možných cest svědění identifikovaných epigenetickou analýzou v klinických studiích potvrzením vzoru exprese pomocí qPCR a funkčních testů na buňkách s CRISPR knockoutem RNA cílů, obchodováním s opiáty, zobrazováním vápníku a elektrofyziologií. Konečně dále vyvíjet společné kultury mezi lidskou kůží a lidskými periferními neurony odvozenými od iPS za účelem provedení funkčních studií.