Behandling af kronisk kløe ved atopisk dermatitis med opioidantagonist Naltrexon

Specifikke mål:

A1 Evaluer den underliggende mekanisme for kløens sværhedsgrad i form af døgnrytme ved at indsamle epidermis på forskellige døgnrytme stadier ved hjælp af sugeblærer. Dette vil blive gjort hos AD-patienter med kronisk kløe. Cellerne vil blive isoleret fra en del af sugeblærerne og brugt til at isolere og sekvensere RNA for at evaluere og sammenligne den differentielle protein- og RNA-ekspression i sugeblister taget fra symptomatiske og ikke-symptomatiske områder hos patienter med AD på forskellige tidspunkter. Efterforskerne vil derefter korrelere symptomerne på kløens sværhedsgrad til clock-gen- og opioidreceptorniveauer og RNA-ekspressionsdifferensmønster. A1 vil blive evalueret af undersøgelsesarm A, og resultaterne fra denne undersøgelse vil tjene til at bestemme tidspunktet for indtagelse af sugeblærerne til de terapeutiske/mekanistiske undersøgelser (arm B og C).

A2 Undersøg den mekanistiske rolle og den terapeutiske effekt af opioidreceptorer ved kronisk kløe. Til dette formål vil et cross-over, placebokontrolleret design blive brugt til at behandle patienter med opioidreceptorantagonist (Naltrexon) ved at udvide vores eksisterende forsøg. Efterforskerne vil indsamle, evaluere, kvantificere og sammenligne den differentielle protein- og RNA-ekspression i epidermis taget af sugeblærer fra symptomatiske og ikke-symptomatiske områder hos patienter med AD i behandling med placebo eller Naltrexon. Transkriptomanalyse vil være fokuseret, men ikke begrænset til, analyse af neuroinflammatoriske og neuronale markører (herunder cytokiner, GPCR og opioidreceptorer). Bekræftelse vil ske ved brug af in-situ hybridisering af biopsier for at korrelere specifik celletype og placering og qPCR-ekspression af in vitro-kulturer. Bindingsundersøgelserne under anvendelse af fluorescerende mærkede opioidligander og internaliseringsmønster vil blive udført.

A3 Test de underliggende mekanismer i opioidsystemet med nerve-keratinocyt interaktion og mulige effekter på kløetransduktion fra hud til nerver ved at bruge en in vitro neuron-keratinocyt co-kultur model. Desuden planlægger efterforskerne at validere kløefremkaldende netværk og veje fundet i A2 ved hjælp af denne in vitro-model og vil være i stand til at evaluere ændringer i calciumfluxtærskel efter eksponering for eksterne stimuli (f.eks. lys eller mekaniske stimuli) på keratinocytter og neuronale somata under forskellige opioideksponeringsbetingelser. De FC-afledte sensoriske neuroner vil blive dyrket sammen med forskellige patient-KC. Efterforskerne vil teste reaktionsmønsteret af KC og transmission af signalet til tilsluttede perifere sensoriske neuroner ved Fluo-4 AM Calcium billeddannelse og elektrofysiologi. Reaktionen vil reagere på lugtstoffet Sandalore, da efterforskerne tidligere har offentliggjort, at Sandalore inducerer disse ønskede calciumfluxer.

Anvend in vitro-epitel-/nervemodellen for at validere mulige kløeveje identificeret ved epigenetisk analyse i de kliniske forsøg ved at bekræfte ekspressionsmønsteret med qPCR og funktionelle assays på celler med CRISPR-knockout af RNA-målene, opioidhandel, calcium-billeddannelse og elektrofysiologi. Endelig videreudvikle co-kulturer mellem menneskelig hud og iPS-afledte humane perifere neuroner for at udføre funktionelle undersøgelser.