Leczenie przewlekłego świądu w atopowym zapaleniu skóry antagonistą opioidowym naltreksonem

Cele szczegółowe:

A1 Oceń leżący u podstaw mechanizm nasilenia świądu pod kątem rytmu okołodobowego, pobierając naskórek na różnych etapach okołodobowych za pomocą pęcherzy do odsysania. Zostanie to zrobione u pacjentów z AD z przewlekłym świądem. Komórki zostaną wyizolowane z części pęcherzy do odsysania i użyte do wyizolowania i sekwencjonowania RNA w celu oceny i porównania zróżnicowanej ekspresji białek i RNA w odsysanym blistrze pobranym z obszarów objawowych i nieobjawowych u pacjentów z AD w różnych punktach czasowych. Badacze następnie skorelują nasilenie objawów świądu z poziomem genu zegarowego i receptora opioidowego oraz różnicowym wzorcem ekspresji RNA. A1 zostanie ocenione przez ramię badania A, a wyniki tego badania posłużą do podjęcia decyzji o punkcie czasowym pobrania blistrów do odsysania do badań terapeutycznych/mechanistycznych (ramię B i C).

A2 Zbadaj mechanistyczną rolę i skuteczność terapeutyczną receptorów opioidowych w przewlekłym świądzie. W tym celu zostanie zastosowany krzyżowy, kontrolowany placebo projekt leczenia pacjentów z antagonistą receptora opioidowego (naltrekson) poprzez rozszerzenie naszego istniejącego badania. Badacze będą zbierać, oceniać, oceniać ilościowo i porównywać zróżnicowaną ekspresję białek i RNA w naskórku pobranym przez odsysanie pęcherzy z obszarów objawowych i nieobjawowych u pacjentów z AZS leczonych placebo lub naltreksonem. Analiza transkryptomu będzie koncentrować się, ale nie tylko, na analizie markerów neurozapalnych i neuronalnych (w tym cytokin, GPCR i receptorów opioidowych). Potwierdzenie nastąpi przy użyciu hybrydyzacji in situ biopsji w celu skorelowania określonego typu i lokalizacji komórek oraz ekspresji qPCR w hodowlach in vitro. Przeprowadzone zostaną badania wiązania z użyciem ligandów opioidowych znakowanych fluorescencyjnie oraz wzorca internalizacji.

A3 Przetestuj podstawowe mechanizmy układu opioidowego z interakcją nerw-keratynocyt i możliwy wpływ na przenoszenie świądu ze skóry na nerwy, używając modelu współhodowli neuronów i keratynocytów in vitro. Ponadto badacze planują zweryfikować sieci i szlaki powodujące swędzenie znalezione w A2 przy użyciu tego modelu in vitro i będą w stanie ocenić zmiany progu przepływu wapnia po ekspozycji na bodźce zewnętrzne (np. światło lub bodźce mechaniczne) na keratynocyty i komórki nerwowe w różnych warunkach ekspozycji na opioidy. Neurony czuciowe pochodzące z FC będą hodowane razem z KC różnych pacjentów. Badacze przetestują wzór reakcji KC i przekazywanie sygnału do połączonych obwodowych neuronów czuciowych za pomocą obrazowania wapnia Fluo-4 AM i elektrofizjologii. Reakcja będzie reagowała na substancję zapachową Sandalore, ponieważ badacze opublikowali wcześniej, że Sandalore indukuje te pożądane strumienie wapnia.

Zastosuj model nabłonkowo-nerwowy in vitro do walidacji możliwych szlaków świądu zidentyfikowanych w analizie epigenetycznej w badaniach klinicznych poprzez potwierdzenie wzorca ekspresji za pomocą qPCR i testów funkcjonalnych na komórkach z nokautem CRISPR celów RNA, przemytem opioidów, obrazowaniem wapnia i elektrofizjologią. Wreszcie, dalsze rozwijanie wspólnych kultur między ludzką skórą a ludzkimi neuronami obwodowymi pochodzącymi z iPS w celu przeprowadzenia badań funkcjonalnych.