Análisis inmunológico del tejido de los ganglios linfáticos después de la inmunoterapia intralinfática: un estudio prospectivo de casos y controles (ILIT-FNA)

Este es un estudio piloto prospectivo, comparativo y clínico abierto. De los pacientes con alergia al polen de gramíneas que se sometieron a un esquema SCIT pretemporada con Polvac™ Grass+RyeSCIT en la Unidad de Alergia de USZ, se reclutarán 30 pacientes para el estudio.

De cuatro a seis semanas después de finalizar el tratamiento SCIT (a la dosis máxima de mantenimiento), los pacientes serán asignados aleatoriamente a uno de dos grupos de tratamiento y recibirán una inyección de alérgeno adicional. Ambos grupos de tratamiento reciben el mismo fármaco, pero a diferentes dosis y vías de administración. Quince pacientes serán asignados para recibir otra inyección subcutánea con 0,5 ml (2000 U) de Polvac Grass+Rye. Los otros 15 pacientes serán asignados para recibir una inyección intralinfática de 0,1 ml de Polvac Grass+Rye con 400 U de alérgeno. Tanto las inyecciones SCIT como ILIT se realizan mediante guía por ultrasonido para asegurar la inyección en el ganglio linfático (ILIT) o 1 cm al lado del ganglio linfático (SCIT).

La PAAF de tejido ganglionar se realizará a las 2, 6 o 24 horas tras la inyección del alérgeno. Al mismo tiempo, la FNA de los ganglios linfáticos contralaterales se realizará como línea de base. Se tomarán muestras de sangre venosa en todas las visitas: al inicio, así como después de 2, 6 o 24 horas, después de 7 días y después de 28 días del alérgeno ILIT o SCIT. La FNA se realiza mediante ecoguiado.

Preparación de drogas:

El vial de medicamento de 1 ml (4000 U/ml) se agita durante 10 segundos. Se desinfecta la cabeza del vial y se extraen 0,5 ml (para SCIT) o 0,1 ml (para ILIT) del medicamento en una jeringa de 1 ml con aguja hipodérmica 23G, asegurándose de que no haya aire en la jeringa ni en la aguja. El medicamento se usa a más tardar 4 horas después de la preparación. Se hacen réplicas de la dosis si se va a realizar más de una inyección. El medicamento restante se desecha.

Aspiración con aguja fina (PAAF):

La FNA es mínimamente invasiva y la realiza un investigador experimentado. Se desinfectará la piel por encima del ganglio linfático y se insertará una aguja estéril (23-25 ​​g), unida a la jeringa de 5 ml, fijada en una pistola FNA, en la corteza del ganglio linfático bajo guía de ultrasonido Doppler color evitando tejidos importantes. y órganos, como vasos sanguíneos grandes y nervios. El émbolo de la jeringa se tira para ajustar el sello a una escala de 2 ml para mantener la presión negativa en la jeringa. Después de girar y aspirar la jeringa 5 veces, la aguja se gira para aspirar en forma de abanico en diferentes trayectorias en el ganglio linfático. La aguja se retira cuando ca. Hay 0,1 ml de tejido en la jeringa. El sitio de punción se cubre con una gasa estéril y se aplica presión con la fuerza adecuada durante 10 min. Los pacientes son observados durante 30 min de observación y dados de alta cuando no hay reacción adversa. La muestra de FNA se enjuagará con medio de congelación de células vivas que contenga dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO al 10% y suero bovino fetal al 90%), se colocará en un criotubo y se congelará a -80 °C.

Extracción de sangre y conservación de células y suero sanguíneo:

La extracción de sangre venosa se realiza justo antes de la SCIT/ILIT, a las 2, 6 o 24 horas posteriores a la SCIT/ILIT ya las 7 y 28 horas posteriores a la SCIT/SLIT. Cada vez, se recogen 25 ml de sangre venosa para la preparación de PBMC y 5 ml de sangre para la preparación del suero. Ambas muestras se procesan mediante métodos internos de rutina en un plazo de 2 horas para la preparación de suero y células. El suero producido se alicuota en muestras de 1 ml y se congela a -20 °C para su posterior análisis. La sangre completa se centrifuga en Ficoll y las PBMC se aíslan y se lavan en PBS antes de volver a suspenderse en medio de congelación de células vivas que contiene DMSO. Se congelan lentamente alícuotas de 1 ml de las células en criotubos y finalmente se almacenan a -80 °C antes del análisis posterior.