Analisi immunologica del tessuto linfonodale dopo immunoterapia intralinfatica: uno studio prospettico caso controllo (ILIT-FNA)

Questo è uno studio pilota prospettico, comparativo, clinico in aperto. Da pazienti con allergia ai pollini di graminacee che si sottopongono a uno schema SCIT pre-stagionale con Polvac™ Grass+RyeSCIT presso l'Unità per le allergie dell'USZ, verranno reclutati 30 pazienti per lo studio.

Da quattro a sei settimane dopo la fine del trattamento con SCIT (alla dose massima di mantenimento), i pazienti saranno randomizzati in uno dei due gruppi di trattamento e riceveranno un'ulteriore iniezione di allergene. Entrambi i gruppi di trattamento ricevono lo stesso farmaco, ma a dosi e vie di somministrazione diverse. Quindici pazienti saranno assegnati a ricevere un'altra iniezione sottocutanea con 0,5 ml (2000 U) di Polvac Grass+Rye. Gli altri 15 pazienti saranno assegnati a ricevere un'iniezione intralinfatica di 0,1 ml Polvac Grass + Rye con 400 U di allergene. Entrambe le iniezioni SCIT e ILIT vengono eseguite mediante guida ecografica per assicurare l'iniezione nel linfonodo (ILIT) o 1 cm vicino al linfonodo (SCIT).

L'FNA del tessuto linfonodale sarà condotto a 2, 6 o 24 ore dopo l'iniezione dell'allergene. Allo stesso tempo, verrà eseguito l'FNA di un linfonodo controlaterale come linea di base. Il sangue venoso verrà prelevato a tutte le visite: al basale così come dopo 2, 6 o 24 ore, dopo 7 giorni e dopo 28 giorni dall'allergene ILIT o SCIT. L'FNA viene eseguito mediante guida ecografica.

Preparazione del farmaco:

La fiala del farmaco da 1 ml (4000 U/ml) viene agitata per 10 secondi. La testa della fiala viene disinfettata e 0,5 ml (per SCIT) o 0,1 ml (per ILIT) del farmaco vengono aspirati in una siringa da 1 ml con ago ipodermico 23G assicurando che non ci sia aria nella siringa o nell'ago. Il farmaco viene utilizzato entro e non oltre 4 ore dopo la preparazione. La replica della dose viene effettuata se deve essere eseguita più di un'iniezione. Il farmaco rimanente viene scartato.

Aspirazione con ago sottile (FNA):

L'FNA è minimamente invasivo ed eseguito da un investigatore esperto. La pelle sopra il linfonodo verrà disinfettata e un ago sterile (23-25 ​​g), attaccato alla siringa da 5 ml, fissato in una pistola FNA, verrà inserito nella corteccia linfonodale sotto guida ecografica color Doppler evitando tessuti importanti e organi, come grandi vasi sanguigni e nervi. Lo stantuffo della siringa viene tirato per impostare il sigillo su una scala di 2 ml al fine di mantenere la pressione negativa nella siringa. Dopo aver ruotato e aspirato la siringa 5 volte, l'ago viene ruotato per aspirare a forma di ventaglio a diverse traiettorie nel linfonodo. L'ago viene ritirato quando ca. Nella siringa sono presenti 0,1 ml di tessuto. Il sito di puntura è coperto con garza sterile e la pressione viene applicata con forza adeguata per 10 min. I pazienti vengono osservati per 30 minuti di osservazione e rilasciati in assenza di reazioni avverse. Il campione di FNA sarà lavato con mezzo di congelamento di cellule vive contenente dimetilsolfossido (DMSO) (10% DMSO e 90% siero bovino fetale (FBS)), messo in un criotubo e congelato a -80°C.

Raccolta del sangue e conservazione delle cellule e del siero sanguigno:

La raccolta del sangue venoso viene eseguita appena prima della SCIT/ILIT, a 2, 6 o 24 ore dopo la SCIT/ILIT e alle 7 e 28 dopo la SCIT/SLIT. Ogni volta, vengono raccolti 25 ml di sangue venoso per la preparazione delle PBMC e 5 ml di sangue per la preparazione del siero. Entrambi i campioni vengono elaborati con metodi interni di routine entro 2 ore per la preparazione del siero e delle cellule. Il siero prodotto viene aliquotato in campioni da 1 ml e congelato a -20 °C per analisi successive. Il sangue intero viene centrifugato su Ficoll e le PBMC isolate e lavate in PBS prima di essere risospese in mezzo di congelamento cellulare vivo contenente DMSO. Aliquote di 1 ml di cellule vengono congelate lentamente in criotubi e infine conservate a -80 °C prima di ulteriori analisi.