Análise imunológica do tecido linfonodal após imunoterapia intralinfática: um estudo prospectivo de caso-controle (ILIT-FNA)

Este é um estudo piloto prospectivo, comparativo, clínico aberto. De pacientes com alergia ao pólen de gramíneas submetidos a um esquema SCIT pré-sazonal com Polvac™ Grass+RyeSCIT na USZ Allergy Unit, 30 pacientes serão recrutados para o estudo.

Quatro a seis semanas após o término do tratamento com SCIT (na dose máxima de manutenção), os pacientes serão randomizados para um dos dois grupos de tratamento e receberão uma injeção adicional de alérgeno. Ambos os grupos de tratamento recebem o mesmo medicamento, mas em doses e vias de administração diferentes. Quinze pacientes serão alocados para receber outra injeção subcutânea com 0,5 ml (2.000 U) de Polvac Grass+Rye. Os outros 15 pacientes serão alocados para receber uma injeção intralinfática de 0,1 ml de Polvac Grass+Rye com 400 U de alérgeno. As injeções de SCIT e ILIT são realizadas por orientação de ultrassom para garantir a injeção no linfonodo (ILIT) ou 1 cm próximo ao linfonodo (SCIT).

A PAAF do tecido linfonodal será realizada 2, 6 ou 24 horas após a injeção do alérgeno. Ao mesmo tempo, FNA de linfonodos contralaterais será realizada como linha de base. O sangue venoso será coletado em todas as visitas: na linha de base, bem como após 2, 6 ou 24 horas, após 7 dias e após 28 dias do alérgeno ILIT ou SCIT. A PAAF é realizada por orientação por ultrassom.

Preparação de medicamentos:

O frasco de medicamento de 1 ml (4000 U/ml) é agitado por 10 segundos. A cabeça do frasco é desinfetada e 0,5 ml (para SCIT) ou 0,1 ml (para ILIT) do medicamento é aspirado para uma seringa de 1 ml com agulha hipodérmica 23G garantindo que não haja ar na seringa ou na agulha. A medicação é usada o mais tardar 4 horas após a preparação. A réplica da dose é feita se mais de uma injeção for realizada. A medicação restante é descartada.

Aspiração por agulha fina (PAAF):

A FNA é minimamente invasiva e realizada por um investigador experiente. A pele acima do linfonodo será desinfetada e uma agulha estéril (23-25g), acoplada à seringa de 5 ml, fixada em uma pistola FNA, será inserida no córtex do linfonodo sob orientação de ultrassom Doppler colorido, evitando tecidos importantes e órgãos, como grandes vasos sanguíneos e nervos. O êmbolo da seringa é puxado para ajustar a vedação em uma escala de 2 ml para manter a pressão negativa na seringa. Após girar e aspirar a seringa 5 vezes, a agulha é girada para aspirar em forma de leque em diferentes trajetórias no linfonodo. A agulha é retirada quando ca. 0,1 ml de tecido está presente na seringa. O local da punção é coberto com gaze estéril e a pressão é aplicada com força adequada por 10 min. Os pacientes são observados por 30 min de observação e liberados quando não há reação adversa. A amostra FNA será enxaguada com dimetil sulfóxido (DMSO) contendo meio de congelamento de células vivas (10% DMSO e 90% soro bovino fetal (FBS)), colocada em um criotubo e congelada a -80°C.

Coleta de sangue e preservação de células e soro sanguíneo:

A coleta de sangue venoso é realizada imediatamente antes da SCIT/ILIT, 2, 6 ou 24 horas após a SCIT/ILIT e 7 e 28 após a SCIT/SLIT. Cada vez, 25 ml de sangue venoso são coletados para preparação de PBMCs e 5 ml de sangue são coletados para preparação de soro. Ambas as amostras são processadas por métodos internos de rotina dentro de 2 horas para preparação de soro e células. O soro produzido é aliquotado em amostras de 1 ml e congelado a -20 °C para posterior análise. O sangue total é centrifugado em Ficoll e as PBMCs isoladas e lavadas em PBS antes de ressuspensas em meio de congelamento de células vivas contendo DMSO. Alíquotas de 1 ml das células são congeladas lentamente em criotubos e finalmente armazenadas a -80 °C antes de análises posteriores.