Imunologická analýza tkáně lymfatických uzlin po intralymfatické imunoterapii: prospektivní případová kontrolní studie (ILIT-FNA)

Toto je prospektivní, srovnávací, klinická otevřená pilotní studie. Z pacientů s alergií na travní pyl, kteří podstoupí předsezónní schéma SCIT s Polvac™ Grass+RyeSCIT na Allergy Unit USZ, bude do studie přijato 30 pacientů.

Čtyři až šest týdnů po ukončení léčby SCIT (při maximální udržovací dávce) budou pacienti randomizováni do jedné ze dvou léčebných skupin a dostanou jednu další injekci alergenu. Obě léčebné skupiny dostávají stejný lék, ale v různých dávkách a způsobech podávání. Patnáct pacientů bude přiděleno k podání další subkutánní injekce s 0,5 ml (2000 U) Polvac Grass+Rye. Ostatním 15 pacientům bude podána intralymfatická injekce 0,1 ml Polvac Grass+Rye se 400 U alergenu. Injekce SCIT i ILIT se provádějí pomocí ultrazvukového navádění, aby se zajistila injekce do lymfatické uzliny (ILIT) nebo 1 cm vedle lymfatické uzliny (SCIT).

FNA tkáně lymfatických uzlin bude provedena 2, 6 nebo 24 hodin po injekci alergenu. Současně bude jako výchozí hodnota provedena FNA kontralaterálních lymfatických uzlin. Venózní krev bude odebírána při všech návštěvách: na začátku i po 2, 6 nebo 24 hodinách, po 7 dnech a po 28 dnech alergenu ILIT nebo SCIT. FNA se provádí pomocí ultrazvukového navádění.

Příprava léku:

1 ml lahvička s lékem (4000 U/ml) se protřepává po dobu 10 sekund. Hlava lahvičky se vydezinfikuje a 0,5 ml (pro SCIT) nebo 0,1 ml (pro ILIT) léku se natáhne do 1 ml injekční stříkačky s 23G hypodermickou jehlou, aby se zajistilo, že ve stříkačce nebo jehle není žádný vzduch. Lék se užívá nejpozději 4 hodiny po přípravě. Pokud má být podána více než jedna injekce, vytvoří se replika dávky. Zbývající léky se vyhodí.

Aspirace tenkou jehlou (FNA):

FNA je minimálně invazivní a provádí ji zkušený vyšetřovatel. Kůže nad lymfatickou uzlinou bude dezinfikována a sterilní jehla (23-25g), připojená k 5ml injekční stříkačce, upevněná ve FNA pistoli, bude zavedena do kůry lymfatických uzlin pod barevným dopplerovským ultrazvukovým vedením, přičemž se vyhneme důležitým tkáním a orgány, jako jsou velké krevní cévy a nervy. Píst stříkačky se vytáhne, aby se těsnění nastavilo na stupnici po 2 ml, aby se ve stříkačce udržoval podtlak. Po pětinásobném otočení a nasátí injekční stříkačky se jehla otočí tak, aby nasála vějířovitým způsobem při různých trajektoriích v lymfatické uzlině. Jehla je vytažena, když ca. Ve stříkačce je přítomno 0,1 ml tkáně. Místo vpichu se překryje sterilní gázou a přiměřenou silou se přitlačí po dobu 10 minut. Pacienti jsou pozorováni po dobu 30 minut a propuštěni, když se neobjeví nežádoucí reakce. Vzorek FNA se promyje zmrazovacím médiem pro živé buňky obsahujícím dimethylsulfoxid (DMSO) (10% DMSO a 90% fetální bovinní sérum (FBS)), umístí se do kryozkumavky a zmrazí na -80 °C.

Odběr krve a uchování buněk a krevního séra:

Odběr žilní krve se provádí těsně před SCIT/ILIT, 2, 6 nebo 24 hodin po SCIT/ILIT a 7 a 28 po SCIT/SLIT. Pokaždé se odebere 25 ml žilní krve pro přípravu PBMC a 5 ml krve se odebere pro přípravu séra. Oba vzorky jsou zpracovány rutinními interními metodami do 2 hodin pro přípravu séra a buněk. Vyrobené sérum se rozdělí na alikvoty do 1 ml vzorků a zmrazí se při -20 °C pro pozdější analýzu. Plná krev se odstředí na Ficoll a PBMC se izolují a promyjí v PBS před resuspendováním v médiu pro zmrazení živých buněk obsahujícím DMSO. 1 ml alikvoty buněk se pomalu zmrazí v kryozkumavkách a nakonec se před další analýzou skladují při -80 °C.