A DHA hatása a lipid- és szénhidrátanyagcsere-változásokra és a testzsír eloszlására HAART alatti HIV-betegeknél.

Hipotézis: A DHA-kezelés képes lenne legalább részben helyreállítani a HAART-hoz kapcsolódó lipidzavarokat, és javítani vagy legalábbis nem rontani a HAART-hoz kapcsolódó zsír újraeloszlást anélkül, hogy további rendellenességeket idézne elő a dendritikus sejtek és a monociták funkcionális képességében.

Változók: a DHA-kezelés hatása az összkoleszterinre és frakcióira, trigliceridekre, inzulinra, fibrinolízis markerekre, tumor nekrózis faktor alfa-ra (TNF-α), valamint antropometriás mérésekkel, bioimpedanciával, ultrahanggal, DEXA-val és hasi CT-vel értékelt zsíreloszlásra. A DHA beadásának hatásai a dendritikus és mononukleáris sejtek fenotípusára és funkcionális képességeire. Célkitűzés: Annak meghatározása, hogy a nagy dózisú, nagy dózisú dokozahexánsavval (DHA) végzett kezelés képes-e teljesen vagy részben visszaállítani a nagyon aktív antiretrovirális terápiával (HAART) kapcsolatos lipidzavarokat és zsír újraeloszlást, valamint a fenotípusra és funkcióra gyakorolt ​​hatásokat. A dendritikus sejtek és monociták száma Adatelemzés: Az alapadatokat a jó egyensúly érdekében elemzik. A Fisher-féle egzakt tesztet a kategorikus változók közötti különbségek felmérésére, a Student-féle t-próbát a folytonos változókra és a Mann-Whitney-tesztet az ordinális változókra használjuk. A fő hatékonysági változó az alapvonal és a végső értékek közötti különbségek lesznek a MANCOVA-modell alkalmazásával, amely az alapértéket kovariánsnak tekinti. A hatékonyságot a két kezelési csoport között a vizsgálat végén a korrigált átlagok kontrasztjával értékelik. A kezelési szándék elemzését fogják használni.

Azokban a központokban, ahol a klinikai nyomkövetést lefolytatják, a következő módszertannal kell elvégezni: A tájékozott beleegyezés megszerzése után demográfiai adatok, HIV-fertőzöttségi állapot, farmakológiai adatok, antropometriai paraméterek gyűjtésével megvizsgálják a beteg kiindulási állapotát, és folytatják. kiegészítő vizsgálat elvégzése a testzsír összetételének, a testzsír eloszlásának azonosítására és meghatározására, valamint a korábban említett paramétereket tartalmazó alapelemzés elvégzésére. Emellett értékelni fogják a betegek higiénés-diétás szokásait, különös tekintettel az alkoholfogyasztásra, a fizikai aktivitásra és az egyidejű gyógyszeres kezelésre. Ezt az eljárást az elmúlt 7 nap visszamenőleges naplóinak készítésével hajtják végre. A páciens napi kalóriabevitelét a Nutrilogic ® szoftver (Bio Logic, Barcelona, ​​España) fogja számszerűsíteni. A fizikai aktivitást a Minnesota-skála fogja számszerűsíteni (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. A minnesotai szabadidős fizikai aktivitás kérdőív validálása spanyol férfiaknál. Am. J. Epidemiol, 139, 1197-1209 (1994)].

Testzsír-összetétel és testzsír-eloszlás: a következő kiegészítő vizsgálatokkal kell elvégezni:

Denzitometria vagy DEXA: Hanyatt fekvő helyzetben, egyenes lábakkal és együtt lábbal, egy denzitometriás készülék szabványos vizsgálóasztalán (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA) határozzák meg. A kezdeti vizsgálatban enerarán a különböző régiók több arcát másoljuk át és adjuk át a későbbi vizsgálatok képeire, hogy csökkentsük az egymást követő meghatározások változékonyságát. Kettős abszorpciós technikával testzsírmérés, testösszetétel és csontsűrűség mérés történik. Az utolsó két esetben a csont ásványianyag-sűrűségének és egy esetleges osteopenia vagy osteopenia, ill. csontritkulás.

Hasi CT: gerincvelő digitális radiográfiával, latero-laterális felvétellel, az L4 lokalizációjával és a csigolyatest közepén áthaladó tomográfiás metszet készítésével készül. Ezt követően az intraabdominális zsír és a bőr alatti zsír digitális számítása történik, manuálisan kiválasztva az érdeklődési területet. A mért területek cm2-ben lesznek megadva.

Laboratóriumi elemzés: a biokémiai meghatározáshoz a vérmintákat 10 ml-es Vacutainer-csövekben veszik adalékanyagok nélkül. A vért szobahőmérsékleten 30 percig alvadjuk, majd 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 15 percig. Miután a szérumot elválasztottuk a vérrögtől (kb. 4-5 ml), 1,5 ml-es alikvot részre osztják (a lipidek vizsgálatára) és 5-7 0,5 ml-es aliquot részre, amelyeket -20 °C-on lefagyasztanak. biokémiai elemzést végeznek.

Plazma lipidek, glükóz, glikozilált hemoglobin, inzulin és C-peptid: az összkoleszterin és triglicerid méréseket a Hitachi 911 automatizált autoanalizátorhoz adaptált automatizált kereskedési módszerekkel (enzim-kolorimetria, Roche Diagnostics) végzik. Az AI, B és C-III apolipoproteinek, valamint a lipoprotein (a) meghatározását a Hitachi 911 automatizált autoanalizátorhoz adaptált kereskedelmi módszerek (immunturbidimetriás vizsgálat, Roche Diagnostics és Wako Chemicals) közvetítik. A koleszterin lipoprotein frakciók (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) meghatározása a következő módszerekkel történik: flotáció ultracentrifugálásával elválasztott VLDL, direkt módszerrel meghatározott koleszterin HDL (Roche Diagnostics) és különbség alapján meghatározott koleszterin LDL. összkoleszterin és VLDL és HDL koleszterin frakciókban. Glükóz: kereskedelmi módszerrel (enzim-kolorimetria, Roche Diagnostics) a Hitachi 747 automatizált autoanalizátorhoz igazítva. A szérum inzulinkoncentrációját nem kompetitív kemilumineszcens enzimes immunoassay (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) segítségével határozzuk meg. . A C-peptid szérumkoncentrációját nem kompetitív kemilumineszcens enzimes immunoassay-vel határozzuk meg (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Az LDL részecskék méretének meghatározása: Az LDL részecskék méretét a teljes plazmából határozzuk meg akrilamid gradiens gélelektroforézissel, nem denaturáló körülmények között. Négy ismert LDL átmérőjű sáv szabványát fogják használni, amelyeket korábban elektronmikroszkóppal határoztak meg.

Zsírsavak meghatározása a plazmában: A kezelés betartását a plazma lipidek zsírsav-összetételének gázkromatográfiával történő meghatározása igazolja. A plazma összes lipidjét Bligh és Dyer módszerével kloroform:metanol (2:1, V:V) eleggyel extraháljuk. A zsírsavak metil-észtereit bór-trifluoriddal metanolban 80 °C-on 60 percig tartó átészterezéssel állítják elő. amely lehetővé teszi az összes lipidvegyület, köztük a PUFA-k nagymértékű visszanyerését. A zsírsavak metil-észtereit tartalmazó alikvot részt gázkromatográfiás készülékkel (Hewlett-Packard 5890-es modell) elemzik 30 m-en. RTX-2330 oszlop (Restek, Bellefonte, PA) 0,25 mm belső átmérővel, lángionizációs detektorral. A vivőgáz 105 kPa nyomású hélium lesz. A különböző vegyületek teljes szétválasztásához két hőmérsékleti beállítást biztosított: 140 °C-200 °C-3 °C/perc vagy két fokozatban 140 °C-180 °C-4 °C/perc és 180 °C. C-210 °C 2 °C/perc sebességgel. Az injektor és a detektor hőmérséklete 260 °C. A detektor lineáris válaszát rendszeresen teszteljük standard keverékekkel. Általában két különböző molekulatömegű belső standardot (13:0 és 23:0 vagy 27:0) használnak. A csúcsokat a D-2500 integrátorral (Hitachi Ltd., Tokió) integrálják, és a retenciós idők szabványokkal való összehasonlításával azonosítják. Ha szükséges, az azonosítást tömegspektrometriával (Hewlett-Packard detektor, modell 5970B) 70 eV ionizációs potenciál mellett meg lehet erősíteni.

A gyulladás markereinek vizsgálata: vért veszünk 5 ml-es EDTA csőben. Az extrakció után a csövet centrifugáljuk, a plazmát eppendorf-csövekbe gyűjtjük, és -70 °C-on lefagyasztjuk a citokinek meghatározásáig. A plazmaminták TNF-alfa, IL-1 béta és IL-6 tartalmát ELISA-val mérik. Minden egyes mintát két példányban elemzünk „R&D Systems” ELISA készlettel, a kereskedelmi szállító specifikációinak megfelelően.

Beavatkozás: A betegeket két kezelési csoport egyikébe (placebo és DHA) randomizálják, egy központi randomizációs lista segítségével. A vizsgálatot a kettős vak vizsgálati módszertan szerint végezzük, amelyben sem a beteg, sem az orvos nem ismeri a betegeknek adott hatóanyagot. A véletlenszerűsítési eljárást bármelyik stratégia hozzárendelésével hajtják végre a PROC PLAN SAS (8.2-es verzió) modul által generált véletlenszerűsítési séma szerint, 2 blokk többszörösében, és a központ szerint rétegzett 1:1 mintát követve. A véletlenszerű beosztásról a fent leírtak szerint listát állítunk össze, és ettől kezdve egy lezárt, átlátszatlan borítékot adunk ki, amelyet sorszámmal és a központ nevével azonosítunk. A borítékokat a központi adatkezelés és -elemzés központjában kell letétbe helyezni, amely telefonos kapcsolattartással koordinálja a központosított randomizálási megbízást.

A betegeket a vizsgálatba való bevonásra értékelik, és személyes adataikat egy speciális adatgyűjtési adatfüzetbe gyűjtik. A tájékoztatáson alapuló beleegyezési eljárás után, és ha a beteg beleegyezik a vizsgálatba, felveszik a kapcsolatot a központosított randomizációs kiosztási központtal. A betegadatok regisztrálásakor a boríték felnyílik, és a pácienshez rendelt stratégiát jelentik a vizsgálónak. Az eljárást a borítékban található dokumentumba kell átírni, a központi randomizációs központ felelős személyének aláírásával és keltezésével.

Az olajsavat (placebót) és a dokozahexaénsavat 500 mg/kapszulát tartalmazó külső megjelenésű kapszulák előzetesen elkészítik. A kapszulák védőburkolattal vannak bevonva, amely a páciens számára észrevehetetlenné teszi az ízét. A DHA napi adagja 4 g lesz. Ugyanilyen időközönként a placebóval kezelt betegek napi 4 g olajsavat kapnak.

Adatgyűjtés: A betegek adatait egy olyan orvos gyűjti, aki teljes egészében a betegek irányításával, az elvégzendő vizsgálatok koordinálásával és az információk adatbázisba történő rögzítésével foglalkozik. Az adatok gyűjtése egy korábban kialakított, speciális gyűjtési adatfüzetben történik.

o Mintaméret értékelése a hatás kimutatásához szükséges résztvevők számának vagy résztvevői éveinek meghatározására.

A minta méretének és az adatok elemzésének becslése:

Várhatóan különbséget tud majd kimutatni az aktív kezelés javára a fő változóban, nevezetesen a triglicerid értékek legalább 20%-os nagyságrendű csökkenésében a követési időszak (48 hét) végén. kovarianciaanalízissel korrigált átlagok összehasonlítása. A saját adatainktól való 86-os becsült szórás szerint, összhangban az irodalmi adatokkal (AIDS 1999, 13:1424-1425), és az előre relevánsnak definiált minimális hatás nagyságrendje (20%-os csökkenés) szerint ez elegendő lenne. csoportonként mintegy 29 értékelhető betegnek. Célja, hogy több beteget toborozzon a várható 10%-os veszteség előrejelzése szerint, vagyis csoportonként 33 alany.

A minta méretének újrabecslése:

Mivel a variabilitást más helyzetekből származó adatokból becsülik (a kezelés előtti alapadatok), és nincsenek konkrét adatok a kísérleti helyzetről (a DHA-kezelés utáni variabilitás), ebben a protokollban előre meghatározott a minta méretének újrabecslése. amikor 4 hetes kezelés után a triglicerid értékek 50%-át követik nyomon. Ehhez a fő változóból származó objektív adatokat, a trigliceridszinteket a kiinduláskor és 4 héttel a kezelés után, a véletlenszerű hozzárendeléssel, de a kódokat elfedve továbbítjuk egy második független statisztikai csoportnak (Katalán Onkológiai Intézet, Epidemiológiai és Rákkutató Intézet). Bejegyzés. Statisztikus: Dr. Victor Moreno) tekintettel a tanulmány központi statisztikai elemzésére (Biostatisztikai és Epidemiológiai Laboratórium (LBE), Klinikai Vizsgálatok Szekció, Barcelonai Autonóm Egyetem. Statisztikus: Dr. Ferran Torres). Ez az új csoport fogja elvégezni az elemzést, és csak a minta méretének újraszámításához fedi fel a variabilitási adatokat. Ha a minta mérete kisebb volt a vártnál, akkor a rendszer a kezdeti terv szerint fog tartani. Semmilyen körülmények között nem végeznek szignifikancia-teszteket, vagy a vizsgálatot idő előtt leállítják másodlagosan a variabilitás újrabecslése érdekében. E módszer szerint nincs szükség a multiplicitás beállítására.

o Tervezze meg a hiányzó adatokat az olyan helyzetek kezelésére, amikor a változók hiányzóként, nem elérhetőként, "nem jelentettként", értelmezhetetlenként szerepelnek, vagy adatkonzisztencia vagy tartományon kívüli eredmények miatt hiányzónak tekinthetők. Hiányzó értékek kezelése

A kezelési szándék szerinti fő elemzéshez minden olyan alanyt fel kell használni, akiknek nincs lényeges eltérése a kiválasztási kritériumoktól, akik legalább egy adagot vettek be a vizsgált gyógyszerből, és akik a fő változót előretekintően értékelték, legalább a következő három hónapon belül. fel. E feltételezés alapján várható, hogy egy 1 éves nyomon követés során olyan alanyokat találnak, akiknél nem végeztek méréseket. Ezért a fő változó hiányzó értékeinek imputálása a következőképpen történik:

• Ha az adatok hiánya hatékonysági problémákra vezethető vissza, vagy az ok ismeretlen, a vizsgálati csoport 95%-os percentilis értékét kell hozzárendelni.
• Egyéb okokból hiányzó adatok esetén a LOCF (Last Observation Carried Forward) módszer kerül bevezetésre, feltéve, hogy az alapmérés után legalább három hónapig rendelkezésre áll egy érték.

A részletes eljárást a statisztikai jelentés tartalmazza, és az adatbázis bezárása előtt a módszer konzisztenciájának értékelését tervezik egy olyan értekezleten, amelyen az anonim listázást megkönnyítik az értékeléshez. „Blind Review”, ahol az eljárás újraértékelhető CPMP/EWP/1776/99: Figyelembe veendő szempontok hiányzó adatok esetén).

A tanulmány nehézségei és korlátai:

A betegek száma és az elvégzett kiegészítő vizsgálatok miatti sajátos kezelésük elkerülhetetlenül bonyolulttá teszi a vizsgálatot. Lesz azonban egy orvos, aki állandóan koordinálja az összes beteget és minden elvégzett vizsgálatot. Ezen túlmenően, a kutatócsoport széles körű konkrét és szinergikus funkciókkal minden kutató számára. Végül a kutatók konszolidált csoportot alkotnak, és hasonló követelményeket támasztó korábbi tanulmányokban tapasztaltak.

o Statisztikai elemzési terv, amely leírja a vizsgálati protokollban vagy tervben meghatározott elsődleges és másodlagos célok elérése érdekében alkalmazandó elemzési elveket és statisztikai technikákat.

Statisztikai elemzés Leíró elemzés

A statisztikai jelentésben a következő leíró indexeket részletezzük a változók jellegének megfelelően:

• Folytonos változókban: Átlag, CI 95%, SD, minimum, P25, medián, P75, max, N és hiányzik. Csoportonként és globálisan.
• Kategorikus változókban: összesen % az oszlophoz viszonyítva, N minden kategóriában. Csoportonként és globálisan.
• Sorrendi változókban: Két táblázattal lesz leírva: az egyik a folytonos változók leíró paramétereit, a másik pedig a kategorikus változókat tartalmazza.

A nyitott mezőkben, vagy ha egy vagy több változó összes esetét szeretné listázni, listákban írjuk le.

Következtetési elemzés Az elsődleges és másodlagos hatékonysági változók statisztikai kezelését az alábbi részben részletesen ismertetjük. Az összes többi változó esetében a megfelelő hipotézistesztet alkalmazzuk annak természetének megfelelően: Fisher egzakt teszt kategorikus változókra, Student t teszt folytonos változókra, Mann-Whitney U teszt ordinális változókra.

A csoportok közötti alaphomogenitás A kezelési csoportok kiindulási összehasonlíthatóságának elemzése a demográfiai változók, kockázati tényezők és klinikai jellemzők tekintetében a felvétel időpontjában történik.

A fő hatékonysági elemzés A hatékonyság fő változóját az ANCOVA-modellt alkalmazó különböző kezelések kiindulási és végértékei közötti különbségek összehasonlításával értékelik a teszt kiindulási értékével, mint kovariánssal. A korrigált átlagokat és a konfidencia-intervallumokat 95%-os (95%) értékben az ANCOVA modellel számítottuk ki. A hatékonyság fő döntési kritériumaként a vizsgálat végpontjában a korrigált átlagok kontrasztját kell elvégezni a két kezelési csoport között. Ezenkívül feltáró szándékként értékelni kell az összehasonlított hatást a megfigyelés különböző időpontjaiban. Ennek a második elemzésnek a feltáró jellege miatt nem kerül sor multiplicitás kiigazításra.

A paraméteres tesztek szerinti esetekben lényeges eltérések esetén nemparametrikus megközelítést alkalmazunk a megfelelő változók tartományainak transzformációjával. A hatékonyság fő elemzése a kezelni kívánt populációval történik. Az eredmények érzékenységének és robusztusságának bizonyítékaként azonban a protokoll-megközelítés szerinti elemzést is megadjuk.

Tolerálhatósági és elfogadhatósági vizsgálatok Minden randomizált és kezelt beteget be kell vonni a biztonsági elemzésbe. A nemkívánatos események előfordulási gyakoriságát a két csoportban a Fisher-féle egzakt teszt segítségével hasonlítjuk össze.

A szignifikancia szintje Minden javasolt statisztikai tesztben a szignifikancia szükséges szintje a hagyományos (p < 0,05 bilaterális). A közbenső elemzés kivételével nem tettek rendelkezéseket a többszörös kiigazítás elvégzésére.