Efeito do DHA nas Alterações do Metabolismo de Lipídeos e Carboidratos e na Distribuição da Gordura Corporal em Pacientes HIV em HAART.

Hipótese: o tratamento com DHA seria capaz de reverter, pelo menos parcialmente, os distúrbios lipídicos associados à HAART e melhorar ou pelo menos não piorar a redistribuição de gordura associada à HAART, sem induzir novos desarranjos nas células dendríticas e na capacidade funcional dos monócitos.

Variáveis: efeitos do tratamento com DHA no colesterol total e suas frações, triglicerídeos, insulina, marcadores de fibrinólise, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e distribuição de gordura avaliada por medidas antropométricas, bioimpedância, ultrassonografia, DEXA e TC abdominal. Efeitos da administração de DHA no fenótipo e capacidades funcionais de células dendríticas e mononucleares. Objetivo: Determinar se o tratamento com altas doses de ácido docosahexanóico (DHA) altamente purificado é capaz de reverter, total ou parcialmente, os distúrbios lipídicos e a redistribuição de gordura associados à terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), e os efeitos no fenótipo e na função de células dendríticas e monócitos Análise de dados: Os dados da linha de base serão analisados ​​para um bom equilíbrio. O teste exato de Fisher será utilizado para avaliar diferenças entre variáveis ​​categóricas, o teste t de Student para variáveis ​​contínuas e o teste de Mann-Whitney para variáveis ​​ordinais. A principal variável de eficácia serão as diferenças entre os valores basais e finais usando o modelo MANCOVA, considerando o valor basal como covariável. A eficácia será avaliada comparando as médias ajustadas no final do estudo entre os dois grupos de tratamento. A intenção de tratar a análise será usada.

A metodologia a ser realizada nos centros onde será realizada a trilha clínica é a seguinte: Após obter o consentimento informado, será examinada a linha de base do paciente com a coleta de dados demográficos, status de infecção pelo HIV, dados farmacológicos, parâmetros antropométricos e prosseguirá realizar um exame complementar destinado a identificar e definir a composição da gordura corporal, a distribuição da gordura corporal e realizar uma análise basal incluindo os parâmetros mencionados anteriormente. Também serão avaliados os hábitos higiênico-dietéticos do paciente com especial atenção ao consumo de álcool, atividade física e medicação concomitante. Este procedimento será realizado fazendo diários retrospectivos dos últimos 7 dias. A ingestão calórica diária do paciente será quantificada pelo software Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​Espanha). A atividade física será quantificada pela escala de Minnesota (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Validação do questionário de atividade física de lazer de Minnesota em homens espanhóis. Am J Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Composição da gordura corporal e distribuição da gordura corporal: será feita com os seguintes testes adicionais:

Densitometria ou DEXA: Será determinada com o paciente em decúbito dorsal com as pernas retas e os pés juntos, em uma mesa de exame padronizada a partir de um aparelho de densitometria (Lunar Prodigy, Madison, WI, EUA). No estudo inicial enerarán mais faces das diferentes regiões que serão copiadas e transferidas para as imagens dos estudos subseqüentes para reduzir a variabilidade de sucessivas determinações. Será realizada a mensuração da gordura corporal, composição corporal e avaliação da densidade mineral óssea pela técnica de dupla absorciometria. Será realizado um "scan" corporal total (composição corporal) ou focado na coluna lombar (osso trabecular) e terço proximal do fêmur (osso cortical) para avaliação nos dois últimos casos de densidade mineral óssea e possível osteopenia ou osteoporose.

TC de abdome: será obtida através da realização de radiografia digital da coluna vertebral, incidência látero-lateral, localizando L4 e obtendo-se um corte tomográfico passando pelo centro do corpo vertebral. Posteriormente, será feito o cálculo digital da gordura intra-abdominal e da gordura subcutânea, selecionando manualmente a área de interesse. As áreas medidas serão feitas em cm2.

Análise laboratorial: as amostras de sangue para determinações bioquímicas serão obtidas em tubos Vacutainer de 10 ml sem aditivos. O sangue será coagulado à temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugado a 2500 rpm por 15 minutos. Após separar o soro do coágulo (cerca de 4-5 ml), será dividido em 1 alíquota de 1,5 ml (para estudo de lipídeos) e 5-7 alíquotas de 0,5 ml que serão congeladas a -20 °C até as análises bioquímicas são realizadas.

Lipídios plasmáticos, glicose, hemoglobina glicosilada, insulina e peptídeo C: as medições de colesterol total e triglicerídeos serão realizadas usando métodos de negociação automatizados (colorimetria enzimática, Roche Diagnostics) adaptados ao autoanalisador automático Hitachi 911. A determinação das apolipoproteínas AI, B e C-III, lipoproteína (a) será realizada por meio de métodos comerciais mediados (ensaio imunoturbidimétrico, Roche Diagnostics e Wako Chemicals) adaptados ao autoanalisador automático Hitachi 911. A determinação das frações lipoproteicas do colesterol (Lipídeos, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) será realizada pelos seguintes métodos: VLDL separado por ultracentrifugação de flotação, colesterol HDL determinado por método direto (Roche Diagnostics) e colesterol LDL determinado por diferença no colesterol total e nas frações do colesterol VLDL e HDL. Glicose: por método comercial (colorimetria enzimática, Roche Diagnostics) adaptado ao autoanalisador automático Hitachi 747. A concentração sérica de insulina será determinada por imunoensaio enzimático quimioluminescente não competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, EUA) . A concentração sérica de peptídeo C é determinada por imunoensaio enzimático quimioluminescente não competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, EUA).

Determinação do tamanho das partículas de LDL: O tamanho das partículas de LDL será determinado a partir do plasma total usando eletroforese em gel de gradiente de acrilamida em condições não desnaturantes. Será utilizado um padrão de quatro bandas conhecidas de diâmetro de LDL, previamente determinado por microscopia eletrônica.

Determinação de ácidos graxos no plasma: A adesão ao tratamento será corroborada pela determinação da composição de ácidos graxos dos lipídios plasmáticos por cromatografia gasosa. Os lipídios totais do plasma serão extraídos pelo método de Bligh e Dyer com clorofórmio:metanol (2:1, V:V). Ésteres metílicos de ácidos graxos serão obtidos por transesterificação com trifluoreto de boro em metanol a 80 °C por 60 min. o que permite uma alta recuperação de todos os compostos lipídicos, incluindo PUFAs. Alíquotas contendo os ésteres metílicos de ácidos graxos serão analisadas com um aparelho de cromatografia gasosa (Hewlett-Packard modelo 5890) em uma distância de 30 m. Coluna RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) com diâmetro interno de 0,25 mm equipada com detector de ionização de chama. O gás de arraste será o hélio a uma pressão de 105 kPa. Para a separação total dos diferentes compostos, forneceu dois ajustes de temperatura: 140 °C-200 °C a 3 °C/min ou em dois estágios de 140 °C-180 °C a 4 °C/min e 180 °C C-210°C a 2°C/min. A temperatura do injetor e do detector é de 260 °C. A resposta linear do detector será testada periodicamente com misturas padrão. Normalmente, serão usados ​​dois padrões internos com peso molecular diferente (13:0 e 23:0 ou 27:0). Os picos serão integrados com um integrador D-2500 (Hitachi Ltd., Tóquio) e identificados por comparação dos tempos de retenção com os padrões. Quando necessário, a identificação pode ser confirmada por espectrometria de massa (detector Hewlett-Packard modelo 5970B) a um potencial de ionização de 70 eV.

Estudo de marcadores de inflamação: sangue será colhido em tubo de 5 ml de EDTA. Após a extração, o tubo será centrifugado, e o plasma coletado em tubos eppendorf e congelado a -70°C até a determinação das citocinas. O conteúdo de TNF-alfa, IL-1 beta e IL-6 nas amostras de plasma será medido por ELISA. Cada amostra será analisada em duplicata utilizando kits ELISA “R&D Systems” seguindo as especificações desse fornecedor comercial.

Intervenção: Os pacientes serão randomizados para um dos dois grupos de tratamento (placebo e DHA), usando uma lista de randomização centralizada. O estudo será conduzido de acordo com a metodologia de ensaio duplo-cego, em que nem o paciente nem o médico desconhecem a substância ativa administrada aos pacientes. O procedimento de randomização será realizado atribuindo uma das estratégias de acordo com um esquema de randomização gerado pelo módulo PROC PLAN SAS (versão 8.2) em múltiplos de 2 blocos e seguindo um padrão 1:1 estratificado por centro. Será gerada uma lista de atribuição aleatória de acordo com o acima mencionado, e a partir da mesma será emitido um envelope opaco lacrado, identificado por um número sequencial e o nome do centro. Os envelopes serão depositados no centro de gerenciamento e análise central de dados, que atuará como coordenador da atribuição de randomização centralizada por contato telefônico.

Os pacientes serão avaliados para inclusão no estudo, e seus dados pessoais coletados em um caderno de coleta de dados específico. Após o procedimento de consentimento informado e se o paciente consentir em ser incluído no estudo, o centro centralizado de randomização será contatado. Ao cadastrar os dados do paciente, o envelope será aberto e a estratégia atribuída ao paciente informada ao investigador. O procedimento deverá ser transcrito em documento contido no envelope, assinando e datando este registro o responsável no centro central de randomização.

Cápsulas com aparência externa idêntica contendo ácido oleico (placebo) e ácido docosahexaenóico nas doses de 500 mg por cápsula serão previamente preparadas. As cápsulas são revestidas com uma capa protetora que torna o sabor imperceptível para o paciente. A dosagem de DHA será de 4 g ao dia. Nos mesmos intervalos, os pacientes do grupo placebo tomarão 4 g por dia de ácido oleico.

Coleta de dados: Os dados dos pacientes serão coletados por um médico inteiramente dedicado a orientar os pacientes, coordenando os exames a serem realizados e registrando as informações em um banco de dados. Os dados serão coletados em um caderno de coleta de dados específico previamente elaborado.

o Avaliação do tamanho da amostra para especificar o número de participantes ou anos de participantes necessários para demonstrar um efeito.

Estimando o tamanho da amostra e análise de dados:

Espera-se poder mostrar uma diferença a favor do tratamento ativo na variável principal, ou seja, redução dos valores de triglicerídeos ao final do período de acompanhamento (48 semanas) de pelo menos 20% de magnitude, no comparação das médias ajustadas por uma análise de covariância. De acordo com o desvio padrão estimado de 86 de nossos próprios dados, consistente com dados da literatura (AIDS 1999, 13:1424-1425), e a magnitude do efeito mínimo pré-definido como relevante (redução de 20%), seria suficiente para cerca de 29 pacientes avaliáveis ​​por grupo. Pretende-se recrutar mais pacientes como previsão de possíveis perdas esperadas da ordem de 10%, ou seja, 33 sujeitos por grupo.

Reestimação do tamanho da amostra:

Como a variabilidade é estimada a partir de dados de outras situações (dados de linha de base pré-tratamento) e não há dados concretos sobre a situação experimental (variabilidade após o tratamento com DHA), é predefinido neste protocolo realizar uma reestimativa do tamanho da amostra quando será obtido um acompanhamento de 50% após 4 semanas de tratamento dos valores de triglicerídeos. Para esses dados objetivos da variável principal, os níveis de triglicerídeos no início e após 4 semanas após o tratamento, juntamente com a atribuição aleatória, mas mascarando os códigos, serão fornecidos a um segundo grupo estatístico independente (Instituto Catalã de Oncologia, Departamento de Epidemiologia e Câncer Cadastro. Estatístico: Dr. Victor Moreno) referente à análise estatística central deste estudo (Laboratório de Bioestatística e Epidemiologia (LBE), Seção de Ensaios Clínicos, Universidade Autônoma de Barcelona. Estatístico: Dr. Ferran Torres). Este novo grupo realizará a análise e apenas revelará dados de variabilidade para recalcular o tamanho da amostra. Se o tamanho da amostra for menor do que o esperado, será mantido de acordo com o desenho inicial. Sob nenhuma circunstância testes de significância serão realizados ou o estudo será interrompido prematuramente secundariamente para reestimar a variabilidade. De acordo com este método, você não precisa de nenhum ajuste de multiplicidade.

o Planejar dados ausentes para abordar situações em que as variáveis ​​são relatadas como ausentes, indisponíveis, "não relatadas", não interpretáveis ​​ou consideradas ausentes devido à inconsistência dos dados ou resultados fora do intervalo Tratamento de valores ausentes

A análise principal por intenção de tratar exigirá o uso de todos os sujeitos sem desvios relevantes dos critérios de seleção, que tenham tomado pelo menos uma dose do medicamento em estudo e que tenham avaliação da variável principal prospectivamente, pelo menos três meses após o acompanhamento acima. Sob esta hipótese, espera-se que em um estudo de acompanhamento de 1 ano encontre indivíduos com medições não feitas. Assim, estabelece-se a imputação dos valores em falta da variável principal da seguinte forma:

• Se a falta de dados for devida a problemas de eficiência, ou a causa for desconhecida, será atribuído o valor do percentil 95% para o grupo de estudo.
• No caso de falta de dados por outros motivos, será implementado o método LOCF (Last Observation Carried Forward) desde que haja disponibilidade de um valor de pelo menos três meses após sua medição de linha de base.

O procedimento detalhado será incluído no relatório estatístico e planeja-se avaliar a consistência do método antes de fechar o banco de dados em uma reunião na qual listagens anônimas serão facilitadas para sua avaliação 'Blind Review' onde o procedimento poderá ser reavaliado ( CPMP/EWP/1776/99: Pontos a considerar sobre dados ausentes).

Dificuldades e limitações do estudo:

O número de pacientes e o manejo peculiar que terão, devido aos exames complementares realizados, tornam o estudo inevitavelmente complexo. No entanto, haverá um médico que coordena permanentemente todos os pacientes e todos os exames realizados. Além disso, a equipe de pesquisa é ampla com funções concretas e sinérgicas para cada pesquisador. Por fim, os pesquisadores constituem um grupo consolidado e com experiência em estudos anteriores com requisitos semelhantes.

o Plano de análise estatística descrevendo os princípios analíticos e as técnicas estatísticas a serem empregadas para atender aos objetivos primários e secundários, conforme especificado no protocolo ou plano do estudo.

Análise estatística Análise descritiva

Os seguintes índices descritivos serão detalhados no relatório estatístico de acordo com a natureza das variáveis:

• Em variáveis ​​contínuas: Média, IC 95%, DP, mínimo, P25, mediana, P75, máx, N e ausente. Por grupo e globalmente.
• Em variáveis ​​categóricas: % total em relação à coluna, N em cada categoria. Por grupo e globalmente.
• Em variáveis ​​ordinais: Serão descritas com duas tabelas: uma com parâmetros descritivos das variáveis ​​contínuas e outra com variáveis ​​categóricas.

Em campos abertos ou quando houver interesse em listar todos os casos para uma ou mais variáveis, serão descritos por listas.

Análise inferencial O tratamento estatístico das variáveis ​​primárias e secundárias de eficácia será especificamente descrito em uma seção abaixo. Para todas as demais variáveis, será aplicado o teste de hipótese adequado de acordo com sua natureza: teste exato de Fisher para variáveis ​​categóricas, teste t de Student para variáveis ​​contínuas, teste U de Mann-Whitney para variáveis ​​ordinais.

Homogeneidade basal entre os grupos Uma análise da comparabilidade basal dos grupos de tratamento será estabelecida em relação às variáveis ​​demográficas, fatores de risco e características clínicas no momento da inclusão.

Análise de eficácia principal A principal variável de eficácia será avaliada comparando a diferença entre os valores basais e finais dos diferentes tratamentos usando o modelo ANCOVA com o valor basal do teste como covariável. Médias ajustadas foram calculadas e intervalos de confiança a 95% (95%) pelo modelo ANCOVA. Como principal critério de decisão de eficácia, será realizado o contraste entre as médias ajustadas no ponto final do estudo entre os dois grupos de tratamento. Adicionalmente e com intuito exploratório, será avaliado o efeito comparado nos diferentes momentos de observação. Nenhum ajuste de multiplicidade será feito devido à natureza exploratória desta segunda análise.

No caso de desvios relevantes nos casos de acordo com os testes paramétricos, será aplicada uma abordagem não paramétrica usando transformações para intervalos das variáveis ​​correspondentes. A análise principal da eficácia será feita com a população que se pretende tratar. No entanto, como prova da sensibilidade e robustez dos resultados, será fornecida a análise sob a abordagem protocolar.

Testes de tolerabilidade e aceitabilidade Todos os pacientes randomizados e tratados serão incluídos na análise de segurança. A frequência de aparecimento de eventos adversos nos dois grupos será comparada por meio do teste exato de Fisher.

Nível de significância Em todos os testes estatísticos propostos, o nível de significância exigido será o convencional (p < 0,05 bilateral). Nenhuma provisão foi feita para realizar qualquer ajuste de multiplicidade, exceto na análise intermediária.