Effekt af DHA på lipid- og kulhydratmetabolismeændringer og kropsfedtfordeling hos HIV-patienter under HAART.

Hypotese: DHA-behandling ville være i stand til i det mindste delvist at vende lipidforstyrrelserne forbundet med HAART og forbedre eller i det mindste ikke forværre fedtomfordelingen forbundet med HAART uden at inducere yderligere forstyrrelser af dendritiske celler og monocytfunktionsevne.

Variabler: effekter af DHA-behandling på total kolesterol og dets fraktioner, triglycerider, insulin, fibrinolysemarkører, tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og fedtfordeling vurderet ved antropometriske målinger, bioimpedans, sonografi, DEXA og abdominal CT. Virkninger af DHA-administration på fænotype og funktionelle evner af dendritiske og mononukleære celler. Formål: At afgøre, om behandling med høje doser af højt oprenset docosahexansyre (DHA) er i stand til helt eller delvist at vende lipidforstyrrelserne og fedtomfordelingen forbundet med højaktiv antiretroviral terapi (HAART), og virkningerne på fænotype og funktion af dendritiske celler og monocytter Dataanalyse: Baseline data vil blive analyseret for en god balance. Fishers eksakte test vil blive brugt til at vurdere forskelle mellem kategoriske variable, Students t-test for kontinuerte variable og Mann-Whitney-test for ordinalvariable. Den vigtigste effektivitetsvariabel vil være forskelle mellem baseline- og slutværdier ved brug af MANCOVA-modellen, der tager udgangspunkt i værdien som kovariabel. Effekten vil blive vurderet ved at sammenligne justerede midler ved afslutningen af ​​undersøgelsen mellem begge behandlingsgrupper. Intention to treat-analyse vil blive brugt.

Metoden til at udføre i de centre, hvor det kliniske spor vil blive udført, er følgende: Efter at have indhentet informeret samtykke, vil patientens baseline blive undersøgt med indsamling af demografiske data, HIV-infektionsstatus, farmakologiske data, antropometriske parametre, og det vil fortsætte. at gennemføre en supplerende undersøgelse designet til at identificere og definere kropsfedtsammensætning, kropsfedtfordeling og at udføre en basal analyse, herunder de tidligere nævnte parametre. Det vil også blive evalueret patientens hygiejnisk-diætetiske vaner med særlig opmærksomhed på alkoholindtagelse, fysisk aktivitet og samtidig medicinering. Denne procedure vil blive udført ved at lave retrospektive dagbøger fra de sidste 7 dage. Patientens daglige kalorieindtag vil blive kvantificeret af Nutrilogic ® softwaren (Bio Logic, Barcelona, ​​España). Fysisk aktivitet vil blive kvantificeret ved Minnesota-skalaen (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Validering af Minnesota-spørgeskemaet om fysisk aktivitet i fritiden hos spanske mænd. Am J Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Kropsfedtsammensætning og kropsfedtfordeling: vil blive udført med følgende yderligere tests:

Densitometri eller DEXA: Vil blive bestemt med patienten i rygliggende stilling med lige ben og fødder sammen, på et standardiseret undersøgelsesbord fra en densitometrianordning (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA). I den indledende undersøgelse enerarán flere ansigter af de forskellige regioner, der vil blive kopieret og overført til billederne af efterfølgende undersøgelser for at reducere variabiliteten af ​​successive bestemmelser. Der vil blive udført en kropsfedtmåling, kropssammensætning og vurdering af knoglemineraltæthed ved dobbelt absorptiometri. Der vil blive udført en total krops "scanning" (kropssammensætning) eller fokuseret på lændehvirvelsøjlen (trabekulær knogle) og proksimal tredjedel af lårbenet (kortikal knogle) til evaluering i de sidste to tilfælde af knoglemineraltæthed og en mulig osteopeni eller osteoporose.

Abdominal CT: Vil blive opnået ved at udføre en spinal digital radiografi, lateral-lateral visning, lokalisering af L4 og få et tomografisk snit, der passerer gennem midten af ​​hvirvellegemet. Efterfølgende vil der være en digital beregning af intra-abdominalt fedt og subkutant fedt, manuelt valg af interesseområdet. De målte arealer vil blive udført i cm2.

Laboratorieanalyse: blodprøver til biokemiske bestemmelser vil blive udtaget i Vacutainer-rør på 10 ml uden tilsætningsstoffer. Blodet vil blive koaguleret ved stuetemperatur i 30 minutter og centrifugeret ved 2500 rpm i 15 minutter. Efter adskillelse af serum fra koagel (ca. 4-5 ml), vil blive opdelt i 1 alikvot på 1,5 ml (til undersøgelse af lipider) og 5-7 alikvoter af 0,5 ml alikvoter, som vil blive frosset ved -20 °C indtil den biokemiske analyse udføres.

Plasmalipider, glucose, glycosyleret hæmoglobin, insulin og C-peptid: Målinger af total kolesterol og triglycerider vil blive udført ved hjælp af automatiserede handelsmetoder (enzymkolorimetri, Roche Diagnostics) tilpasset den automatiske autoanalyzer Hitachi 911. Bestemmelsen af ​​apolipoproteinerne AI, B og C-III, lipoprotein (a) vil blive afholdt som medierende kommercielle metoder (immunoturbidimetrisk assay, Roche Diagnostics og Wako Chemicals) tilpasset den automatiserede autoanalyzer Hitachi 911. Bestemmelsen af ​​kolesterollipoproteinfraktioner (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) vil blive udført ved følgende metoder: VLDL adskilt ved ultracentrifugering af flotation, kolesterol HDL bestemt ved en direkte metode (Roche Diagnostics) og kolesterol LDL bestemt ved forskel i total kolesterol og VLDL- og HDL-kolesterolfraktioner. Glukose: ved en kommerciel metode (enzymkolorimetri, Roche Diagnostics) tilpasset den automatiske autoanalyzer Hitachi 747. Seruminsulinkoncentration vil blive bestemt ved ikke-konkurrerende kemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) . Serumkoncentrationen af ​​C-peptid bestemmes ved ikke-konkurrerende kemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Bestemmelse af størrelsen af ​​LDL-partikler: Størrelsen af ​​LDL-partikler vil blive bestemt ud fra total plasma ved anvendelse af akrylamidgradientgelelektroforese under ikke-denaturerende betingelser. Vil blive brugt en standard af fire kendte LDL-diameterbånd, tidligere bestemt ved elektronmikroskopi.

Bestemmelse af fedtsyrer i plasma: Behandlingscompliance vil blive bekræftet ved at bestemme fedtsyresammensætningen af ​​plasmalipider ved gaskromatografi. Totale plasmalipider vil blive ekstraheret ved metoden ifølge Bligh og Dyer med chloroform:methanol (2:1, V:V). Methylestere af fedtsyrer opnås ved transesterificering med bortrifluorid i methanol ved 80 °C i 60 min. som tillader en høj genvinding af alle lipidforbindelserne inklusive PUFA'er. Aliquot indeholdende methylestere af fedtsyrer vil blive analyseret med en gaskromatografianordning (Hewlett-Packard model 5890) på en 30 m. RTX-2330 kolonne (Restek, Bellefonte, PA) med en indvendig diameter på 0,25 mm udstyret med en flammeioniseringsdetektor. Bæregassen vil være helium ved et tryk på 105 kPa. Til den totale adskillelse af de forskellige forbindelser har den forsynet med to temperaturindstillinger: 140 °C-200 °C til 3 °C/min eller i to trin på 140 °C-180 °C til 4 °C/min og 180 °C C-210°C ved 2°C/min. Temperaturen på injektoren og detektoren er 260 °C. Detektorens lineære respons vil blive testet periodisk med standardblandinger. Typisk vil to interne standarder med forskellig molekylvægt (13:0 og 23:0 eller 27:0) blive brugt. Peaks vil blive integreret med en integrator D-2500 (Hitachi Ltd., Tokyo) og identificeret ved sammenligning af retentionstider med standarder. Når det er nødvendigt, kan identifikationen bekræftes ved massespektrometri (Hewlett-Packard detektor model 5970B) ved et ioniseringspotentiale på 70 eV.

Undersøgelse af markører for inflammation: blod vil blive udtaget i 5 ml EDTA-rør. Efter ekstraktion vil røret blive centrifugeret, og plasma opsamlet i eppendorf-rør og frosset ved -70°C indtil cytokinbestemmelse. Indholdet af TNF-alfa, IL-1 beta og IL-6 i plasmaprøverne vil blive målt ved ELISA. Hver prøve vil blive analyseret i to eksemplarer ved hjælp af ELISA-kits "R & D Systems" efter specifikationerne fra den kommercielle leverandør.

Intervention: Patienter vil blive randomiseret til en af ​​to behandlingsgrupper (placebo og DHA) ved hjælp af en centraliseret randomiseringsliste. Undersøgelsen vil blive udført i henhold til den dobbeltblindede forsøgsmetodologi, hvor hverken patienten eller lægen er uvidende om det aktive stof, som gives til patienterne. Randomiseringsproceduren vil blive udført ved at tildele begge strategier i henhold til et randomiseringsskema genereret af modulet PROC PLAN SAS (version 8.2) i multiple af 2 blokke og følge et mønster 1:1 lagdelt efter center. En liste over tilfældige tildelinger vil genereres i henhold til ovennævnte, og fra samme vil der blive udstedt en forseglet uigennemsigtig konvolut, identificeret med et løbenummer og navnet på centret. Kuverterne skal deponeres i centrum for central datastyring og analyse, som vil fungere som koordinator for den centraliserede randomiseringsopgave ved telefonisk kontakt.

Patienter vil blive evalueret for inklusion i undersøgelsen, og deres personlige data vil blive indsamlet i en specifik indsamlingsdatabog. Efter informeret samtykke-proceduren, og hvis patienten giver samtykke til at blive inkluderet i undersøgelsen, vil det centraliserede randomiseringscenter blive kontaktet. Når patientdata er registreret, vil kuverten blive åbnet, og strategien tildelt patienten rapporteret til investigator. Proceduren skal transskriberes til et dokument indeholdt i kuverten, underskrive og datere dette register den ansvarlige på det centrale randomiseringscenter.

Kapsler med identisk ydre udseende indeholdende oliesyre (placebo) og docosahexaensyre i doser på 500 mg pr. kapsel vil blive klargjort på forhånd. Kapslerne er belagt med et beskyttende dæksel, som gør, at den smager umærkelig for patienten. Doseringen af ​​DHA vil være på 4 g dagligt. Med samme intervaller vil patienter i placebogruppen tage 4 g dagligt oliesyre.

Dataindsamling: Patienternes data vil blive indsamlet af en læge, der udelukkende er dedikeret til at vejlede patienter, koordinere tests, der skal udføres, og registrere information i en database. Data vil blive indsamlet i en tidligere designet specifik indsamlingsdatanotesbog.

o Prøvestørrelsesvurdering for at specificere antallet af deltagere eller deltagerår, der er nødvendigt for at påvise en effekt.

Estimering af stikprøvestørrelse og dataanalyse:

Det forventes at kunne vise en forskel til fordel for den aktive behandling i hovedvariablen, nemlig reduktion i triglyceridværdier ved slutningen af ​​opfølgningsperioden (48 uger) på mindst 20 % i størrelsesordenen, i sammenligning af midlerne justeret ved en kovariansanalyse. Ifølge den estimerede standardafvigelse på 86 fra vores egne data, i overensstemmelse med litteraturdata (AIDS 1999, 13:1424-1425), og størrelsen af ​​minimumseffekten foruddefineret som relevant (20 % reduktion), ville det være nok til omkring 29 evaluerbare patienter pr. gruppe. Det er hensigten at rekruttere flere patienter efter forudsigelse af mulige forventede tab på omkring 10 %, eller med andre ord 33 forsøgspersoner pr. gruppe.

Genvurdering af stikprøvestørrelsen:

Da variabiliteten er estimeret ud fra data fra andre situationer (baseline data før behandling), og der ikke er nogen konkrete data om den eksperimentelle situation (variabilitet efter DHA-behandling), er det foruddefineret i denne protokol at udføre en revurdering af prøvestørrelsen hvornår vil der blive opnået en opfølgning på de 50 % efter 4 ugers behandling af triglyceridværdierne. Til dette objektive data fra hovedvariablen vil triglyceridniveauer ved baseline og efter 4 uger efter behandling, sammen med den tilfældige tildeling, men maskering af koderne, blive givet til en anden uafhængig statistisk gruppe (Catalan Institute of Oncology, Department of Epidemiology and Cancer Registrering. Statistiker: Dr. Victor Moreno) respekt for central statistisk analyse af denne undersøgelse (Laboratory of Biostatistics and Epidemiology (LBE), Sektion Kliniske Forsøg, Autonomous University of Barcelona. Statistiker: Dr. Ferran Torres). Denne nye gruppe vil udføre analysen og vil kun afsløre variabilitetsdata for at genberegne stikprøvestørrelsen. Hvis prøvestørrelsen var mindre end forventet, vil den blive vedligeholdt i henhold til det oprindelige design. Under ingen omstændigheder vil der blive udført signifikanstest, eller undersøgelsen vil blive stoppet for tidligt sekundært for at genberegne variabiliteten. Ifølge denne metode behøver du ikke nogen justering af multiplicitet.

o Planlæg manglende data for at løse situationer, hvor variabler rapporteres som manglende, utilgængelige, "ikke-rapporterede", ufortolkelige eller anses for manglende på grund af datainkonsistens eller resultater uden for rækkevidde Behandling af manglende værdier

Hovedanalysen med intention om at behandle vil kræve, at man bruger alle forsøgspersoner uden relevante afvigelser fra udvælgelseskriterierne, som de har taget mindst én dosis af den undersøgte medicin, og som har evaluering af hovedvariablen fremadrettet, mindst tre måneder efter det følgende op. Under denne antagelse forventes det, at der i en 1-årig undersøgelsesopfølgning finder forsøgspersoner med målinger, der ikke er foretaget. Derfor er det angivet imputeringen af ​​manglende værdier af hovedvariablen som følger:

• Hvis manglen på data skyldes effektivitetsproblemer, eller årsagen er ukendt, tilskrives 95 % percentilværdien for undersøgelsesgruppen.
• I tilfælde af manglende data af andre årsager, vil LOCF-metoden (Last Observation Carried Forward) blive implementeret, forudsat at der er en værdi på mindst tre måneder efter dens baseline-måling.

Den detaljerede procedure vil blive inkluderet i den statistiske rapport, og det planlægges at evaluere konsistensen af ​​metoden, før databasen lukkes på et møde, hvor anonyme lister vil blive faciliteret til dens evaluering 'Blind Review', hvor proceduren kan revurderes ( CPMP/EWP/1776/99: Punkter at overveje ved manglende data).

Undersøgelsens vanskeligheder og begrænsninger:

Antallet af patienter og den ejendommelige behandling, som de vil have, på grund af de yderligere udførte tests, gør undersøgelsen uundgåeligt kompleks. Der vil dog være en læge, som permanent koordinerer alle patienter og alle udførte tests. Derudover er forskerholdet bredt med konkrete og synergistiske funktioner for hver enkelt forsker. Endelig udgør forskere en konsolideret gruppe og har erfaring med tidligere undersøgelser med lignende krav.

o Statistisk analyseplan, der beskriver de analytiske principper og statistiske teknikker, der skal anvendes for at opfylde de primære og sekundære mål, som specificeret i undersøgelsesprotokollen eller -planen.

Statistisk analyse Deskriptiv analyse

Følgende beskrivende indekser vil blive detaljeret i den statistiske rapport i overensstemmelse med arten af ​​variablerne:

• I kontinuerte variable: Middel, CI 95%, SD, minimum, P25, median, P75, max, N og mangler. Per gruppe og globalt.
• I kategoriske variable: % total i forhold til kolonnen, N i hver kategori. Per gruppe og globalt.
• I ordinalvariabler: De vil blive beskrevet med to tabeller: en med beskrivende parametre for de kontinuerte variable og den anden med kategoriske variable.

I åbne felter eller når er interesseret i at liste alle tilfælde for en eller flere variabler, vil blive beskrevet af lister.

Inferentiel analyse Den statistiske behandling af de primære og sekundære effektivitetsvariabler vil blive specifikt beskrevet i et afsnit nedenfor. For alle andre variabler vil den passende hypotesetest blive anvendt i henhold til dens art: Fisher eksakt test for kategoriske variable, Student t test for kontinuerte variable, Mann-Whitney U test for ordinal variable.

Basal homogenitet mellem grupper En analyse af baseline sammenligneligheden af ​​behandlingsgrupper vil blive etableret vedrørende demografiske variabler, risikofaktorer og kliniske karakteristika på tidspunktet for inklusion.

Hovedeffektivitetsanalyse Hovedvariablen for effektivitet vil blive evalueret ved at sammenligne forskellen mellem baseline- og slutværdier for de forskellige behandlinger ved brug af ANCOVA-modellen med testens baselineværdi som kovariat. Justerede gennemsnit blev beregnet og konfidensintervaller på 95 % (95 %) ved ANCOVA-modellen. Som det vigtigste beslutningskriterium for effektivitet vil kontrasten mellem de justerede gennemsnit ved endepunktet af undersøgelsen mellem de to behandlingsgrupper blive udført. Derudover og som en udforskende hensigt skal den sammenlignede effekt evalueres på de forskellige observationstidspunkter. Der vil ikke blive foretaget multiplicitetsjusteringer på grund af den undersøgende karakter af denne anden analyse.

I tilfælde af relevante afvigelser i tilfældene i henhold til de parametriske test, vil der blive anvendt en ikke-parametrisk tilgang ved hjælp af transformationer til områder af de tilsvarende variable. Hovedanalysen af ​​effekten vil blive udført med den population, der er beregnet til at behandle. Men som bevis på resultaternes følsomhed og robusthed vil analysen under protokoltilgangen blive leveret.

Tolerabilitets- og acceptabilitetstest Alle patienter, der er blevet randomiseret og behandlet, vil blive inkluderet i sikkerhedsanalysen. Hyppigheden af ​​forekomsten af ​​uønskede hændelser i de to grupper vil blive sammenlignet ved hjælp af Fishers eksakte test.

Signifikansniveau I alle foreslåede statistiske test skal det krævede signifikansniveau være det konventionelle (p < 0,05 bilateralt). Der er ikke truffet foranstaltninger til at udføre en multiplicitetsjustering undtagen i den mellemliggende analyse.