Effet du DHA sur les altérations du métabolisme des lipides et des glucides et sur la répartition des graisses corporelles chez les patients VIH sous HAART.

Hypothèse : le traitement par DHA serait capable d'inverser, au moins partiellement, les perturbations lipidiques associées au HAART et d'améliorer ou du moins de ne pas aggraver la redistribution des graisses associée au HAART, sans induire de perturbations supplémentaires des cellules dendritiques et de la capacité fonctionnelle des monocytes.

Variables : effets du traitement au DHA sur le cholestérol total et ses fractions, les triglycérides, l'insuline, les marqueurs de la fibrinolyse, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et la répartition des graisses évaluées par des mesures anthropométriques, la bioimpédance, l'échographie, la DEXA et la TDM abdominale. Effets de l'administration de DHA sur le phénotype et les capacités fonctionnelles des cellules dendritiques et mononucléaires. Objectif : Déterminer si un traitement avec de fortes doses d'acide docosahexanoïque hautement purifié (DHA) est capable d'inverser, totalement ou partiellement, les perturbations lipidiques et la redistribution des graisses associées à la thérapie antirétrovirale hautement active (HAART), ainsi que les effets sur le phénotype et la fonction des cellules dendritiques et des monocytes Analyse des données : Les données de base seront analysées pour un bon équilibre. Le test exact de Fisher sera utilisé pour évaluer les différences entre les variables catégorielles, le test t de Student pour les variables continues et le test de Mann-Whitney pour les variables ordinales. La principale variable d'efficacité sera les différences entre les valeurs initiales et finales en utilisant le modèle MANCOVA en prenant la valeur initiale comme covariable. L'efficacité sera évaluée en comparant les moyennes ajustées à la fin de l'étude entre les deux groupes de traitement. L'analyse en intention de traiter sera utilisée.

La méthodologie à effectuer dans les centres où l'essai clinique sera effectué est la suivante : Après avoir obtenu le consentement éclairé, la ligne de base du patient sera examinée avec la collecte de données démographiques, le statut d'infection par le VIH, les données pharmacologiques, les paramètres anthropométriques, et il se poursuivra réaliser un examen complémentaire visant à identifier et définir la composition de la graisse corporelle, la répartition de la graisse corporelle et à effectuer une analyse basale incluant les paramètres précédemment mentionnés. Il sera également évalué les habitudes hygiéno-diététiques du patient avec une attention particulière à la consommation d'alcool, l'activité physique et les médicaments concomitants. Cette procédure sera réalisée en faisant des journaux rétrospectifs des 7 derniers jours. L'apport calorique quotidien du patient sera quantifié par le logiciel Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​España). L'activité physique sera quantifiée par l'échelle du Minnesota (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Validation du questionnaire sur l'activité physique pendant les loisirs du Minnesota chez les hommes espagnols. Am J Epidemiol 1994, 139 : 1197-1209).

Composition de la graisse corporelle et répartition de la graisse corporelle : se fera avec les tests supplémentaires suivants :

Densitométrie ou DEXA : Sera déterminé avec le patient en décubitus dorsal avec les jambes tendues et les pieds joints, sur une table d'examen standardisée à partir d'un appareil de densitométrie (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA). Dans l'étude initiale enerarán plus de visages des différentes régions qui seront copiés et transférés aux images d'études ultérieures pour réduire la variabilité des déterminations successives. Il sera effectué une mesure de la graisse corporelle, de la composition corporelle et une évaluation de la densité minérale osseuse par la technique d'absorptiométrie double. Il sera réalisé un "scan" corporel total (composition corporelle) ou focalisé sur le rachis lombaire (os trabéculaire) et le tiers proximal du fémur (os cortical) pour l'évaluation dans les deux derniers cas d'une densité minérale osseuse et d'une éventuelle ostéopénie ou l'ostéoporose.

Scanner abdominal : Sera obtenu en réalisant une radiographie numérique du rachis, vue latéro-latérale, localisant L4 et obtenant une coupe tomographique passant par le centre du corps vertébral. Par la suite, il y aura un calcul numérique de la graisse intra-abdominale et de la graisse sous-cutanée, en sélectionnant manuellement la zone d'intérêt. Les surfaces mesurées se feront en cm2.

Analyse en laboratoire : les échantillons de sang pour les déterminations biochimiques seront obtenus dans des tubes Vacutainer de 10 ml sans additifs. Le sang sera coagulé à température ambiante pendant 30 minutes et centrifugé à 2500 tr/min pendant 15 minutes. Après séparation du sérum du caillot (environ 4-5 ml), sera divisé en 1 aliquote de 1,5 ml (pour l'étude des lipides) et 5-7 aliquotes de 0,5 ml aliquotes qui seront congelées à -20 °C jusqu'à l'analyse biochimique est effectuée.

Lipides plasmatiques, glucose, hémoglobine glycosylée, insuline et peptide C : les mesures du cholestérol total et des triglycérides seront réalisées à l'aide de méthodes d'échange automatisées (colorimétrie enzymatique, Roche Diagnostics) adaptées à l'autoanalyseur automatisé Hitachi 911. Le dosage des apolipoprotéines AI, B et C-III, lipoprotéine (a) se déroulera par des méthodes commerciales médiates (dosage immunoturbidimétrique, Roche Diagnostics et Wako Chemicals) adaptées à l'autoanalyseur automatisé Hitachi 911. Le dosage des fractions lipoprotéiques du cholestérol (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) sera effectué par les méthodes suivantes : VLDL séparées par ultracentrifugation de flottation, cholestérol HDL déterminé par une méthode directe (Roche Diagnostics) et cholestérol LDL déterminé par différence dans le cholestérol total et les fractions de cholestérol VLDL et HDL. Glucose : par une méthode commerciale (colorimétrie enzymatique, Roche Diagnostics) adaptée à l'autoanalyseur automatisé Hitachi 747. La concentration sérique d'insuline sera déterminée par immunoessai enzymatique chimiluminescent non compétitif (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) . La concentration sérique du peptide C est déterminée par immunodosage enzymatique chimiluminescent non compétitif (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Détermination de la taille des particules de LDL : La taille des particules de LDL sera déterminée à partir du plasma total en utilisant une électrophorèse sur gel à gradient d'acrylamide dans des conditions non dénaturantes. On utilisera un étalon de quatre bandes de diamètre de LDL connues, préalablement déterminées par microscopie électronique.

Détermination des acides gras dans le plasma : L'observance du traitement sera corroborée par la détermination de la composition en acides gras des lipides plasmatiques par chromatographie en phase gazeuse. Les lipides totaux du plasma seront extraits par la méthode de Bligh et Dyer avec du chloroforme : méthanol (2:1, V : V). Les esters méthyliques d'acides gras seront obtenus par transestérification avec du trifluorure de bore dans du méthanol à 80 °C pendant 60 min. ce qui permet une récupération élevée de tous les composés lipidiques dont les PUFA. L'aliquote contenant les esters méthyliques d'acides gras sera analysée avec un appareil de chromatographie en phase gazeuse (Hewlett-Packard modèle 5890) sur un 30 m. Colonne RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) d'un diamètre interne de 0,25 mm équipée d'un détecteur à ionisation de flamme. Le gaz porteur sera de l'hélium à une pression de 105 kPa. Pour la séparation totale des différents composés, il a fourni deux réglages de température : 140 °C-200 °C à 3 °C/min ou en deux étapes de 140°C-180°C à 4°C/min et 180° C-210°C à 2°C/min. La température de l'injecteur et du détecteur est de 260 °C. La réponse linéaire du détecteur sera testée périodiquement avec des mélanges standards. En règle générale, deux étalons internes de poids moléculaire différent (13:0 et 23:0 ou 27:0) seront utilisés. Les pics seront intégrés avec un intégrateur D-2500 (Hitachi Ltd., Tokyo) et identifiés par comparaison des temps de rétention avec des standards. Si nécessaire, l'identification peut être confirmée par spectrométrie de masse (détecteur Hewlett-Packard modèle 5970B) à un potentiel d'ionisation de 70 eV.

Etude des marqueurs de l'inflammation : le sang sera prélevé dans un tube EDTA de 5 ml. Après extraction, le tube sera centrifugé, et le plasma collecté dans des tubes Eppendorf et congelé à -70°C jusqu'au dosage des cytokines. La teneur en TNF-alpha, IL-1 beta et IL-6 dans les échantillons de plasma sera mesurée par ELISA. Chaque échantillon sera analysé en double à l'aide des kits ELISA « R&D Systems » suivant le cahier des charges de ce fournisseur commercial.

Intervention : Les patients seront randomisés dans l'un des deux groupes de traitement (placebo et DHA), à l'aide d'une liste de randomisation centralisée. L'étude sera menée selon la méthodologie de l'essai en double aveugle, dans laquelle ni le patient ni le médecin n'ignorent la substance active administrée aux patients. La procédure de randomisation sera effectuée en attribuant l'une ou l'autre stratégie selon un schéma de randomisation généré par le module PROC PLAN SAS (version 8.2) en multiple de 2 blocs et suivant un schéma 1:1 stratifié par centre. Une liste d'assignation aléatoire sera générée conformément à ce qui précède, et à partir de celle-ci sera émise une enveloppe opaque scellée, identifiée par un numéro séquentiel et le nom du centre. Les enveloppes seront déposées au centre central de gestion et d'analyse des données, qui agira en tant que coordinateur de la randomisation centralisée par contact téléphonique.

Les patients seront évalués pour inclusion dans l'étude, et leurs données personnelles collectées dans un cahier de données de collecte spécifique. A l'issue de la procédure de consentement éclairé et si le patient accepte d'être inclus dans l'étude, le centre centralisé de randomisation sera contacté. Lorsque les données du patient sont enregistrées, l'enveloppe sera ouverte et la stratégie attribuée au patient sera signalée à l'investigateur. La procédure est transcrite dans un document contenu dans l'enveloppe, en signant et en datant ce registre la personne responsable au centre central de randomisation.

Des gélules d'aspect extérieur identique contenant de l'acide oléique (placebo) et de l'acide docosahexaénoïque à la dose de 500 mg par gélule seront préalablement préparées. Les gélules sont recouvertes d'une enveloppe protectrice qui rend le goût imperceptible pour le patient. Le dosage de DHA sera de 4 g par jour. Aux mêmes intervalles, les patients du groupe placebo prendront 4 g d'acide oléique par jour.

Collecte des données : Les données des patients seront recueillies par un médecin qui se consacrera entièrement à guider les patients, à coordonner les tests à effectuer et à enregistrer les informations dans une base de données. Les données seront collectées dans un carnet de collecte spécifique préalablement conçu.

o Évaluation de la taille de l'échantillon pour préciser le nombre de participants ou d'années-participants nécessaires pour démontrer un effet.

Estimation de la taille de l'échantillon et analyse des données :

On s'attend à ce qu'il puisse montrer une différence en faveur du traitement actif dans la variable principale, à savoir, la réduction des valeurs de triglycérides à la fin de la période de suivi (48 semaines) d'au moins 20 % en amplitude, dans le comparaison des moyennes ajustées par une analyse de covariance. Selon l'écart-type estimé de 86 à partir de nos propres données, conformément aux données de la littérature (AIDS 1999, 13:1424-1425), et l'ampleur de l'effet minimum prédéfini comme pertinent (réduction de 20 %), il suffirait à quelque 29 patients évaluables par groupe. Il est prévu de recruter plus de patients en prévision d'éventuelles pertes attendues d'environ 10%, soit en d'autres termes, 33 sujets par groupe.

Réestimation de la taille de l'échantillon :

Étant donné que la variabilité est estimée à partir de données provenant d'autres situations (données de base avant le traitement) et qu'il n'y a pas de données concrètes sur la situation expérimentale (variabilité après traitement au DHA), il est prédéfini dans ce protocole d'effectuer une ré-estimation de la taille de l'échantillon quand sera obtenu un suivi des 50% après 4 semaines de traitement des valeurs de triglycérides. Pour cela, les données objectives de la variable principale, les niveaux de triglycérides au départ et après 4 semaines après le traitement, ainsi que l'assignation aléatoire mais masquant les codes seront fournies à un deuxième groupe statistique indépendant (Institut catalan d'oncologie, Département d'épidémiologie et de cancérologie Inscription. Statisticien : Dr. Victor Moreno) par rapport à l'analyse statistique centrale de cette étude (Laboratoire de Biostatistique et d'Épidémiologie (LBE), Section Essais Cliniques, Université Autonome de Barcelone. Statisticien : Dr Ferran Torres). Ce nouveau groupe effectuera l'analyse et ne révélera que les données de variabilité pour recalculer la taille de l'échantillon. Si la taille de l'échantillon était inférieure à celle prévue, elle sera maintenue conformément à la conception initiale. En aucun cas des tests de signification ne seront effectués ou l'étude sera arrêtée prématurément secondairement pour réestimer la variabilité. Selon cette méthode, vous n'avez besoin d'aucun ajustement de multiplicité.

o Planifier les données manquantes pour traiter les situations où les variables sont signalées comme manquantes, indisponibles, « non déclarées », ininterprétables ou considérées comme manquantes en raison de l'incohérence des données ou de résultats hors plage Traitement des valeurs manquantes

L'analyse principale en intention de traiter nécessitera d'utiliser tous les sujets sans écarts pertinents par rapport aux critères de sélection, qu'ils ont pris au moins une dose du médicament étudié et qui ont une évaluation de la variable principale de manière prospective, au moins à trois mois du suivi en haut. Sous cette hypothèse, on s'attend à ce que dans une étude de suivi d'un an, on trouve des sujets dont les mesures n'ont pas été effectuées. Par conséquent, il est prévu l'imputation des valeurs manquantes de la variable principale comme suit :

• Si le manque de données est dû à des problèmes d'efficacité, ou si la cause est inconnue, la valeur centile de 95 % sera attribuée au groupe d'étude.
• En cas de données manquantes pour d'autres raisons, la méthode LOCF (Last Observation Carried Forward) sera mise en œuvre à condition de disposer d'une valeur d'au moins trois mois après sa mesure de référence.

La procédure détaillée sera incluse dans le rapport statistique et il est prévu d'évaluer la cohérence de la méthode avant de fermer la base de données lors d'une réunion au cours de laquelle des listes anonymes seront facilitées pour son évaluation "Blind Review" où la procédure peut être réévaluée ( CPMP/EWP/1776/99 : Points à considérer sur les données manquantes).

Difficultés et limites de l'étude :

Le nombre de patients et la prise en charge particulière qu'ils auront, du fait des tests complémentaires pratiqués, rendent l'étude forcément complexe. Cependant, il y aura un médecin qui coordonne en permanence tous les patients et tous les tests effectués. De plus, l'équipe de recherche est large avec des fonctions concrètes et synergiques pour chaque chercheur. Enfin, les chercheurs constituent un groupe consolidé et sont expérimentés dans des études antérieures avec des exigences similaires.

o Plan d'analyse statistique décrivant les principes analytiques et les techniques statistiques à utiliser pour répondre aux objectifs primaires et secondaires, tels que spécifiés dans le protocole ou le plan d'étude.

Analyse statistique Analyse descriptive

Les indices descriptifs suivants seront détaillés dans le rapport statistique selon la nature des variables :

• En variables continues : Moyenne, IC 95%, SD, minimum, P25, médiane, P75, max, N et manquant. Par groupe et globalement.
• Dans les variables catégorielles : % total par rapport à la colonne, N dans chaque catégorie. Par groupe et globalement.
• En variables ordinales : Elles seront décrites avec deux tableaux : l'un avec les paramètres descriptifs des variables continues et l'autre avec les variables catégorielles.

Dans les champs ouverts ou lorsque sont intéressés à lister tous les cas pour une ou plusieurs variables, seront décrits par des listes.

Analyse inférentielle Le traitement statistique des variables d'efficacité primaires et secondaires sera spécifiquement décrit dans une section ci-dessous. Pour toutes les autres variables, le test d'hypothèse approprié sera appliqué selon sa nature : test exact de Fisher pour les variables catégorielles, test t de Student pour les variables continues, test U de Mann-Whitney pour les variables ordinales.

Homogénéité basale entre les groupes Une analyse de la comparabilité de base des groupes de traitement sera établie concernant les variables démographiques, les facteurs de risque et les caractéristiques cliniques au moment de l'inclusion.

Analyse principale de l'efficacité La principale variable d'efficacité sera évaluée en comparant la différence entre les valeurs initiales et finales des différents traitements à l'aide du modèle ANCOVA avec la valeur initiale du test comme covariable. Les moyennes ajustées ont été calculées et les intervalles de confiance à 95 % (95 %) par le modèle ANCOVA. Comme principal critère de décision d'efficacité, le contraste entre les moyennes ajustées au point final de l'étude entre les deux groupes de traitement sera effectué. De plus et à titre exploratoire, l'effet comparé aux différents moments d'observation sera évalué. Aucun ajustement de multiplicité ne sera effectué en raison de la nature exploratoire de cette deuxième analyse.

En cas d'écarts pertinents dans les cas résultant des tests paramétriques, il sera appliqué une approche non paramétrique utilisant des transformations en plages des variables correspondantes. L'analyse principale de l'efficacité se fera sur la population à traiter. Cependant, comme preuve de la sensibilité et de la robustesse des résultats, l'analyse selon l'approche protocolaire sera fournie.

Tests de tolérance et d'acceptabilité Tous les patients qui ont été randomisés et traités seront inclus dans l'analyse de sécurité. La fréquence d'apparition des événements indésirables dans les deux groupes sera comparée à l'aide du test exact de Fisher.

Niveau de signification Dans tous les tests statistiques proposés, le niveau de signification requis doit être le niveau conventionnel (p < 0,05 bilatéral). Aucune disposition n'a été prise pour effectuer un ajustement de multiplicité, sauf dans l'analyse intermédiaire.