Efecto del DHA sobre las alteraciones del metabolismo de los lípidos y carbohidratos y la distribución de la grasa corporal en pacientes con VIH bajo TARGA.

Hipótesis: El tratamiento con DHA sería capaz de revertir, al menos parcialmente, las alteraciones de lípidos asociadas con HAART y mejorar o al menos no empeorar la redistribución de grasa asociada con HAART, sin inducir más alteraciones en las células dendríticas y la capacidad funcional de los monocitos.

Variables: efectos del tratamiento con DHA sobre el colesterol total y sus fracciones, triglicéridos, insulina, marcadores de fibrinólisis, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y distribución de la grasa evaluada mediante medidas antropométricas, bioimpedancia, ecografía, DEXA y TC abdominal. Efectos de la administración de DHA sobre el fenotipo y las capacidades funcionales de las células dendríticas y mononucleares. Objetivo: Determinar si el tratamiento con altas dosis de ácido docosahexanoico (DHA) altamente purificado es capaz de revertir, total o parcialmente, las alteraciones lipídicas y la redistribución de grasas asociadas a la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), y los efectos sobre el fenotipo y la función de células dendríticas y monocitos Análisis de datos: Los datos de referencia se analizarán para lograr un buen equilibrio. Se utilizará la prueba exacta de Fisher para evaluar diferencias entre variables categóricas, la prueba t de Student para variables continuas y la prueba de Mann-Whitney para variables ordinales. La principal variable de eficacia serán las diferencias entre los valores iniciales y finales utilizando el modelo MANCOVA tomando el valor inicial como covariable. La eficacia se evaluará contrastando las medias ajustadas al final del estudio entre ambos grupos de tratamiento. Se utilizará el análisis por intención de tratar.

La metodología a realizar en los centros donde se realizará el ensayo clínico es la siguiente: Luego de obtener el consentimiento informado, se examinará la línea de base del paciente con la recolección de datos demográficos, estado de infección por VIH, datos farmacológicos, parámetros antropométricos, y se procederá realizar un examen complementario diseñado para identificar y definir la composición de la grasa corporal, la distribución de la grasa corporal y realizar un análisis basal que incluya los parámetros antes mencionados. También se evaluarán los hábitos higiénico-dietéticos del paciente con especial atención a la ingesta de alcohol, actividad física y medicación concomitante. Este trámite se realizará mediante la realización de diarios retrospectivos de los últimos 7 días. Se cuantificará la ingesta calórica diaria del paciente mediante el software Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​España). La actividad física se cuantificará mediante la escala de Minnesota (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Validación del cuestionario de actividad física en el tiempo libre de Minnesota en hombres españoles. Am J Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Composición de la grasa corporal y distribución de la grasa corporal: se realizará con las siguientes pruebas complementarias:

Densitometría o DEXA: Se determinará con el paciente en decúbito supino con las piernas estiradas y los pies juntos, en una mesa de exploración estandarizada de un dispositivo de densitometría (Lunar Prodigy, Madison, WI, EE. UU.). En el estudio inicial se enerarán más rostros de las diferentes regiones que serán copiados y trasladados a las imágenes de los estudios posteriores para reducir la variabilidad de las sucesivas determinaciones. Se realizará una medición de la grasa corporal, composición corporal y valoración de la densidad mineral ósea mediante técnica de absorciometría dual. Se realizará un "scan" corporal total (composición corporal) o enfocado a columna lumbar (hueso trabecular) y tercio proximal de fémur (hueso cortical) para la evaluación en estos dos últimos casos de densidad mineral ósea y una posible osteopenia o osteoporosis.

TAC de abdomen: Se obtendrá realizando una radiografía digital de columna, vista latero-lateral, localizando L4 y obteniendo un corte tomográfico pasando por el centro del cuerpo vertebral. Posteriormente se realizará un cálculo digital de grasa intraabdominal y grasa subcutánea, seleccionando manualmente la zona de interés. Las áreas medidas se harán en cm2.

Análisis de laboratorio: las muestras de sangre para determinaciones bioquímicas se obtendrán en tubos Vacutainer de 10 ml sin aditivos. La sangre se coagulará a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugará a 2500 rpm durante 15 minutos. Tras separar el suero del coágulo (unos 4-5 ml), se dividirá en 1 alícuota de 1,5 ml (para el estudio de lípidos) y 5-7 alícuotas de 0,5 ml que se congelarán a -20 °C hasta se realizan los análisis bioquímicos.

Lípidos plasmáticos, glucosa, hemoglobina glicosilada, insulina y péptido C: las mediciones de colesterol total y triglicéridos se realizarán mediante métodos de negociación automatizados (colorimetría enzimática, Roche Diagnostics) adaptados al autoanalizador automático Hitachi 911. La determinación de las apolipoproteínas AI, B y C-III, lipoproteína (a) se realizará mediante métodos comerciales (ensayo inmunoturbidimétrico, Roche Diagnostics y Wako Chemicals) adaptados al autoanalizador automatizado Hitachi 911. La determinación de las fracciones lipoproteicas de colesterol (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) se realizará por los siguientes métodos: VLDL separadas por ultracentrifugación de flotación, colesterol HDL determinado por método directo (Roche Diagnostics) y colesterol LDL determinado por diferencia en colesterol total y fracciones de colesterol VLDL y HDL. Glucosa: por un método comercial (colorimetría enzimática, Roche Diagnostics) adaptado al autoanalizador automatizado Hitachi 747. La concentración de insulina sérica se determinará por inmunoensayo enzimático quimioluminiscente no competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Ángeles, CA, EE. UU.) . La concentración sérica de péptido C se determina mediante inmunoensayo enzimático quimioluminiscente no competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Ángeles, CA, EE. UU.).

Determinación del tamaño de las partículas de LDL: El tamaño de las partículas de LDL se determinará a partir del plasma total mediante electroforesis en gel de gradiente de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes. Se utilizará un estándar de cuatro bandas de diámetro LDL conocidas, previamente determinadas por microscopía electrónica.

Determinación de ácidos grasos en plasma: El cumplimiento del tratamiento se corroborará determinando la composición de ácidos grasos de los lípidos plasmáticos por cromatografía de gases. Los lípidos totales del plasma se extraerán por el método de Bligh y Dyer con cloroformo:metanol (2:1, V:V). Los ésteres metílicos de ácidos grasos se obtendrán por transesterificación con trifluoruro de boro en metanol a 80 °C durante 60 min. lo que permite una alta recuperación de todos los compuestos lipídicos incluidos los PUFA. La alícuota que contiene los ésteres metílicos de ácidos grasos se analizará con un dispositivo de cromatografía de gases (Hewlett-Packard modelo 5890) en un 30 m. Columna RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) con un diámetro interno de 0,25 mm equipada con un detector de ionización de llama. El gas portador será helio a una presión de 105 kPa. Para la separación total de los diferentes compuestos se ha previsto dos ajustes de temperatura: 140°C-200°C a 3°C/min o en dos etapas de 140°C-180°C a 4°C/min y 180° C-210°C a 2°C/min. La temperatura del inyector y del detector es de 260 °C. La respuesta lineal del detector se probará periódicamente con mezclas estándar. Por lo general, se utilizarán dos estándares internos con diferente peso molecular (13:0 y 23:0 o 27:0). Los picos se integrarán con un integrador D-2500 (Hitachi Ltd., Tokio) y se identificarán mediante la comparación de los tiempos de retención con los estándares. Cuando sea necesario, la identificación puede confirmarse por espectrometría de masas (detector Hewlett-Packard modelo 5970B) a un potencial de ionización de 70 eV.

Estudio de marcadores de inflamación: se extraerá sangre en tubo de EDTA de 5 ml. Después de la extracción, el tubo se centrifugará y el plasma se recogerá en tubos eppendorf y se congelará a -70 °C hasta la determinación de citoquinas. El contenido de TNF-alfa, IL-1 beta e IL-6 en las muestras de plasma se medirá por ELISA. Cada muestra será analizada por duplicado utilizando kits ELISA “R&D Systems” siguiendo las especificaciones de ese proveedor comercial.

Intervención: Los pacientes serán asignados al azar a uno de dos grupos de tratamiento (placebo y DHA), usando una lista de aleatorización centralizada. El estudio se realizará según la metodología de ensayo doble ciego, en el que ni el paciente ni el médico desconocen el principio activo administrado a los pacientes. El procedimiento de aleatorización se realizará asignando cualquiera de las estrategias según un esquema de aleatorización generado por el módulo PROC PLAN SAS (versión 8.2) en múltiplos de 2 bloques y siguiendo un patrón 1:1 estratificado por centro. Se generará una lista de asignación aleatoria de acuerdo a lo anterior, ya partir de la misma se entregará un sobre opaco cerrado, identificado con un número correlativo y el nombre del centro. Los sobres se depositarán en el centro de gestión y análisis de datos central, que actuará como coordinador de la asignación de aleatorización centralizada mediante contacto telefónico.

Los pacientes serán evaluados para su inclusión en el estudio, y sus datos personales recogidos en un cuaderno de recogida de datos específico. Después del procedimiento de consentimiento informado y si el paciente acepta ser incluido en el estudio, se contactará al centro de asignación de aleatorización centralizado. Cuando se registren los datos del paciente, se abrirá el sobre y se informará al investigador sobre la estrategia asignada al paciente. El procedimiento se transcribirá en un documento contenido en el sobre, firmando y fechando este registro el responsable en el centro central de aleatorización.

Previamente se prepararán cápsulas de idéntico aspecto externo que contengan ácido oleico (placebo) y ácido docosahexaenoico a dosis de 500 mg por cápsula. Las cápsulas están recubiertas con una cubierta protectora que hace que su sabor sea imperceptible para el paciente. La dosis de DHA será de 4 g diarios. A los mismos intervalos, los pacientes del grupo placebo tomarán 4 g diarios de ácido oleico.

Recopilación de datos: Los datos de los pacientes serán recopilados por un médico dedicado íntegramente a orientar a los pacientes, coordinar las pruebas a realizar y registrar la información en una base de datos. Los datos se recogerán en un cuaderno de recogida de datos específico previamente diseñado.

o Evaluación del tamaño de la muestra para especificar el número de participantes o años de participantes necesarios para demostrar un efecto.

Estimación del tamaño de la muestra y análisis de datos:

Se espera poder mostrar una diferencia a favor del tratamiento activo en la variable principal, a saber, reducción de los valores de triglicéridos al final del período de seguimiento (48 semanas) de al menos un 20% en magnitud, en el comparación de las medias ajustadas por un análisis de covarianza. Según la desviación estándar estimada de 86 a partir de nuestros propios datos, consistente con los datos de la literatura (AIDS 1999, 13:1424-1425), y la magnitud del efecto mínimo predefinido como relevante (20% de reducción), sería suficiente a unos 29 pacientes evaluables por grupo. Se pretende reclutar más pacientes como previsión de posibles pérdidas esperadas en torno al 10%, es decir, 33 sujetos por grupo.

Reestimación del tamaño de la muestra:

Dado que la variabilidad se estima a partir de datos de otras situaciones (datos de referencia previos al tratamiento) y no hay datos concretos sobre la situación experimental (variabilidad después del tratamiento con DHA), en este protocolo está predefinido realizar una nueva estimación del tamaño de la muestra. cuando se obtendrá un seguimiento del 50% después de 4 semanas de tratamiento de los valores de triglicéridos. Para ello, los datos de la variable principal, los niveles de triglicéridos al inicio y a las 4 semanas postratamiento, junto con la asignación aleatoria pero enmascarando los códigos, se facilitarán a un segundo grupo estadístico independiente (Instituto Catalán de Oncología, Departamento de Epidemiología y Cáncer). Registro. Estadístico: Dr. Víctor Moreno) respecto al análisis estadístico central de este estudio (Laboratorio de Bioestadística y Epidemiología (LBE), Sección Ensayos Clínicos, Universidad Autónoma de Barcelona. Estadístico: Dr. Ferran Torres). Este nuevo grupo realizará el análisis y solo revelará datos de variabilidad para recalcular el tamaño de la muestra. Si el tamaño de la muestra fuera menor al esperado, se mantendrá de acuerdo al diseño inicial. En ningún caso se realizarán pruebas de significancia o se detendrá el estudio de forma prematura y secundaria para reestimar la variabilidad. De acuerdo con este método, no necesita ningún ajuste de multiplicidad.

o Plan para datos faltantes para abordar situaciones en las que las variables se informan como faltantes, no disponibles, "no informadas", no interpretables o consideradas faltantes debido a la inconsistencia de los datos o resultados fuera de rango Tratamiento de valores faltantes

El análisis principal por intención de tratar requerirá utilizar todos los sujetos sin desviaciones relevantes de los criterios de selección, que hayan tomado al menos una dosis del medicamento estudiado y que tengan evaluación de la variable principal de forma prospectiva, al menos a los tres meses del seguimiento. arriba. Bajo este supuesto, se espera que en un estudio de seguimiento de 1 año se encuentren sujetos con mediciones no realizadas. Por lo tanto, se establece la imputación de los valores faltantes de la variable principal de la siguiente manera:

• Si la falta de datos se debe a problemas de eficiencia, o se desconoce la causa, se atribuirá el valor del percentil 95% para el grupo de estudio.
• En caso de falta de datos por otras razones, se implementará el método LOCF (Last Observation Carried Forward) siempre que se disponga de un valor de al menos tres meses después de su medición de línea de base.

El procedimiento detallado se incluirá en el informe estadístico y se prevé evaluar la consistencia del método antes de cerrar la base de datos en una reunión en la que se facilitarán listados anónimos para su evaluación 'Blind Review' donde se podrá reevaluar el procedimiento ( CPMP/EWP/1776/99: Puntos a considerar sobre datos faltantes).

Dificultades y limitaciones del estudio:

El número de pacientes y el peculiar manejo que tendrán, debido a las pruebas complementarias que se realizan, hacen inevitablemente complejo el estudio. No obstante, habrá un médico que coordinará permanentemente a todos los pacientes y todas las pruebas realizadas. Además, el equipo de investigación es amplio con funciones concretas y sinérgicas para cada investigador. Finalmente, los investigadores constituyen un grupo consolidado y tienen experiencia en estudios previos con requerimientos similares.

o Plan de análisis estadístico que describa los principios analíticos y las técnicas estadísticas que se emplearán para abordar los objetivos primarios y secundarios, tal como se especifica en el protocolo o plan de estudio.

Análisis estadístico Análisis descriptivo

En el informe estadístico se detallarán los siguientes índices descriptivos de acuerdo con la naturaleza de las variables:

• En variables continuas: Media, IC 95%, DE, mínimo, P25, mediana, P75, máx, N y faltantes. Por grupo y globalmente.
• En variables categóricas: % total respecto a la columna, N en cada categoría. Por grupo y globalmente.
• En variables ordinales: Se describirán con dos tablas: una con parámetros descriptivos de las variables continuas y otra con variables categóricas.

En campos abiertos o cuando se interese enumerar todos los casos para una o más variables, se describirán mediante listas.

Análisis inferencial El tratamiento estadístico de las variables primarias y secundarias de eficacia se describirá específicamente en un apartado a continuación. Para el resto de variables se aplicará el test de hipótesis adecuado según su naturaleza: test exacto de Fisher para variables categóricas, test t de Student para variables continuas, test U de Mann-Whitney para variables ordinales.

Homogeneidad basal entre grupos Se establecerá un análisis de la comparabilidad basal de los grupos de tratamiento en cuanto a variables demográficas, factores de riesgo y características clínicas en el momento de la inclusión.

Análisis de eficacia principal La principal variable de eficacia se evaluará comparando la diferencia entre los valores basales y finales de los diferentes tratamientos utilizando el modelo ANCOVA con el valor basal de la prueba como covariable. Se calcularon medias ajustadas e intervalos de confianza al 95% (95%) por el modelo ANCOVA. Como principal criterio de decisión de eficacia se realizará el contraste entre las medias ajustadas al final del estudio entre los dos grupos de tratamiento. Adicionalmente y con carácter exploratorio, se evaluará el efecto comparado en los diferentes momentos de observación. No se realizarán ajustes de multiplicidad debido a la naturaleza exploratoria de este segundo análisis.

En caso de desviaciones relevantes en los casos conforme a las pruebas paramétricas, se aplicará un enfoque no paramétrico utilizando transformaciones a rangos de las variables correspondientes. El análisis principal de la eficacia se hará con la población que se pretende tratar. Sin embargo, como evidencia de la sensibilidad y robustez de los resultados, se aportará el análisis bajo el enfoque de protocolo.

Pruebas de tolerabilidad y aceptabilidad Todos los pacientes que hayan sido aleatorizados y tratados se incluirán en el análisis de seguridad. La frecuencia de aparición de eventos adversos en los dos grupos se comparará mediante la prueba exacta de Fisher.

Nivel de significancia En todas las pruebas estadísticas propuestas el nivel de significación exigido será el convencional (p < 0,05 bilateral). No se han hecho provisiones para realizar ningún ajuste de multiplicidad excepto en el análisis intermedio.