Effetto del DHA sulle alterazioni del metabolismo dei lipidi e dei carboidrati e sulla distribuzione del grasso corporeo nei pazienti affetti da HIV sottoposti a HAART.

Ipotesi: il trattamento con DHA sarebbe in grado di invertire, almeno in parte, i disturbi lipidici associati alla HAART e di migliorare o almeno non peggiorare la ridistribuzione del grasso associata alla HAART, senza indurre ulteriori alterazioni delle cellule dendritiche e della capacità funzionale dei monociti.

Variabili: effetti del trattamento con DHA su colesterolo totale e sue frazioni, trigliceridi, insulina, marcatori di fibrinolisi, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e distribuzione del grasso valutata mediante misurazioni antropometriche, bioimpedenza, ecografia, DEXA e TC addominale. Effetti della somministrazione di DHA sul fenotipo e sulle capacità funzionali delle cellule dendritiche e mononucleate. Obiettivo: determinare se il trattamento con alte dosi di acido docosaesanoico (DHA) altamente purificato è in grado di annullare, totalmente o in parte, i disturbi lipidici e la ridistribuzione del grasso associati alla terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART) e gli effetti sul fenotipo e sulla funzione di cellule dendritiche e monociti Analisi dei dati: i dati di riferimento saranno analizzati per un buon equilibrio. Verranno utilizzati il ​​test esatto di Fisher per valutare le differenze tra variabili categoriali, il test t di Student per le variabili continue e il test di Mann-Whitney per le variabili ordinali. La principale variabile di efficacia saranno le differenze tra i valori basali e quelli finali utilizzando il modello MANCOVA prendendo il valore basale come covariabile. L'efficacia sarà valutata confrontando le medie aggiustate alla fine dello studio tra entrambi i gruppi di trattamento. Verrà utilizzata l'analisi dell'intenzione di trattare.

Le metodologie da eseguire nei centri dove verrà condotto il percorso clinico sono le seguenti: Dopo aver ottenuto il consenso informato, verrà esaminata la baseline del paziente con la raccolta di dati demografici, stato di infezione da HIV, dati farmacologici, parametri antropometrici, e si procederà condurre un esame complementare progettato per identificare e definire la composizione del grasso corporeo, la distribuzione del grasso corporeo e per eseguire un'analisi basale che includa i parametri precedentemente menzionati. Verranno inoltre valutate le abitudini igienico-dietetiche del paziente con particolare attenzione all'assunzione di alcol, all'attività fisica e ai farmaci concomitanti. Questa procedura verrà eseguita creando diari retrospettivi degli ultimi 7 giorni. L'apporto calorico giornaliero del paziente sarà quantificato dal software Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​España). L'attività fisica sarà quantificata dalla scala del Minnesota (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Convalida del questionario sull'attività fisica del tempo libero del Minnesota negli uomini spagnoli. Am J Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Composizione del grasso corporeo e distribuzione del grasso corporeo: saranno eseguiti con i seguenti test aggiuntivi:

Densitometria o DEXA: sarà determinato con il paziente in posizione supina con le gambe dritte e i piedi uniti, su un lettino da esame standardizzato da un dispositivo densitometrico (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA). Nello studio iniziale si enerarán più facce delle diverse regioni che verranno copiate e trasferite alle immagini degli studi successivi per ridurre la variabilità delle determinazioni successive. Verrà eseguita una misurazione del grasso corporeo, della composizione corporea e della densità minerale ossea mediante la tecnica della doppia assorbimentometria. Verrà eseguita una "scansione" total body (composizione corporea) o focalizzata sul rachide lombare (osso trabecolare) e sul terzo prossimale del femore (osso corticale) per la valutazione negli ultimi due casi della densità minerale ossea e di un'eventuale osteopenia o osteoporosi.

TAC addominale: sarà ottenuto eseguendo una radiografia digitale spinale, vista latero-laterale, localizzando L4 e ottenendo una sezione tomografica che passa attraverso il centro del corpo vertebrale. Successivamente si procederà al calcolo digitale del grasso intraddominale e del grasso sottocutaneo, selezionando manualmente l'area di interesse. Le aree misurate saranno fatte in cm2.

Analisi di laboratorio: i campioni di sangue per le determinazioni biochimiche saranno ottenuti in provette Vacutainer da 10 ml senza additivi. Il sangue sarà coagulato a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugato a 2500 rpm per 15 minuti. Dopo aver separato il siero dal coagulo (circa 4-5 ml), verrà suddiviso in 1 aliquota da 1,5 ml (per lo studio dei lipidi) e 5-7 aliquote da 0,5 ml che verranno congelate a -20 °C fino al l'analisi biochimica è effettuata.

Lipidi plasmatici, glucosio, emoglobina glicosilata, insulina e peptide C: le misurazioni del colesterolo totale e dei trigliceridi saranno eseguite utilizzando metodi di trading automatico (colorimetria enzimatica, Roche Diagnostics) adattati all'autoanalizzatore automatico Hitachi 911. La determinazione delle apolipoproteine ​​AI, B e C-III, lipoproteina (a) si svolgerà mediante metodi commerciali mediati (test immunoturbidimetrico, Roche Diagnostics e Wako Chemicals) adattati all'autoanalizzatore automatico Hitachi 911. La determinazione delle frazioni lipoproteiche del colesterolo (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) sarà effettuata con le seguenti metodiche: VLDL separate per ultracentrifugazione di flottazione, colesterolo HDL determinato con metodo diretto (Roche Diagnostics) e colesterolo LDL determinato per differenza nel colesterolo totale e nelle frazioni di colesterolo VLDL e HDL. Glucosio: con un metodo commerciale (colorimetria enzimatica, Roche Diagnostics) adattato all'autoanalizzatore automatico Hitachi 747. La concentrazione sierica di insulina sarà determinata mediante immunodosaggio enzimatico chemiluminescente non competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) . La concentrazione sierica del peptide C è determinata mediante saggio immunoenzimatico chemiluminescente non competitivo (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Determinazione della dimensione delle particelle LDL: La dimensione delle particelle LDL sarà determinata dal plasma totale mediante elettroforesi su gel in gradiente di acrilammide in condizioni non denaturanti. Verrà utilizzato uno standard di quattro bande di diametro LDL note, precedentemente determinate mediante microscopia elettronica.

Determinazione degli acidi grassi nel plasma: la compliance al trattamento sarà corroborata determinando la composizione in acidi grassi dei lipidi plasmatici mediante gascromatografia. I lipidi totali del plasma saranno estratti con il metodo di Bligh and Dyer con cloroformio:metanolo (2:1, V:V). Gli esteri metilici degli acidi grassi saranno ottenuti mediante transesterificazione con trifluoruro di boro in metanolo a 80 °C per 60 min. che consente un elevato recupero di tutti i composti lipidici compresi i PUFA. L'aliquota contenente gli esteri metilici degli acidi grassi sarà analizzata con un dispositivo di gascromatografia (Hewlett-Packard modello 5890) su un 30 m. Colonna RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) con diametro interno 0,25 mm dotata di rivelatore a ionizzazione di fiamma. Il gas di trasporto sarà l'elio alla pressione di 105 kPa. Alla totale separazione dei diversi composti ha provveduto con due impostazioni di temperatura: 140°C-200°C a 3°C/min o in due stadi di 140°C-180°C a 4°C/min e 180° C-210°C a 2°C/min. La temperatura dell'iniettore e del rivelatore è di 260 °C. La risposta lineare del rivelatore sarà testata periodicamente con miscele standard. Tipicamente, verranno utilizzati due standard interni con diverso peso molecolare (13:0 e 23:0 o 27:0). I picchi saranno integrati con un integratore D-2500 (Hitachi Ltd., Tokyo) e identificati confrontando i tempi di ritenzione con gli standard. Se necessario, l'identificazione può essere confermata mediante spettrometria di massa (rivelatore Hewlett-Packard modello 5970B) a un potenziale di ionizzazione di 70 eV.

Studio dei marcatori di infiammazione: il sangue verrà prelevato in provette EDTA da 5 ml. Dopo l'estrazione, la provetta sarà centrifugata e il plasma raccolto in provette eppendorf e congelato a -70°C fino alla determinazione delle citochine. Il contenuto di TNF-alfa, IL-1 beta e IL-6 nei campioni di plasma sarà misurato mediante ELISA. Ogni campione verrà analizzato in duplicato utilizzando i kit ELISA “R&D Systems” seguendo le specifiche del fornitore commerciale.

Intervento: i pazienti saranno randomizzati in uno dei due gruppi di trattamento (placebo e DHA), utilizzando un elenco di randomizzazione centralizzato. Lo studio sarà condotto secondo la metodologia dello studio in doppio cieco, in cui né il paziente né il medico sono a conoscenza del principio attivo somministrato ai pazienti. La procedura di randomizzazione verrà eseguita assegnando entrambe le strategie secondo uno schema di randomizzazione generato dal modulo PROC PLAN SAS (versione 8.2) in multipli di 2 blocchi e seguendo uno schema 1:1 stratificato per centro. Verrà generato un elenco di assegnazione casuale secondo quanto sopra indicato, ea partire dallo stesso verrà emessa una busta opaca sigillata, identificata da un numero progressivo e dal nome del centro. Le buste saranno depositate presso il centro di gestione e analisi dati centrale, che fungerà da coordinatore dell'assegnazione centralizzata di randomizzazione tramite contatto telefonico.

I pazienti saranno valutati per l'inclusione nello studio e i loro dati personali raccolti in uno specifico quaderno di dati di raccolta. Dopo la procedura di consenso informato e se il paziente acconsente ad essere incluso nello studio, verrà contattato il centro di assegnazione della randomizzazione centralizzato. Quando i dati del paziente vengono registrati, la busta verrà aperta e la strategia assegnata al paziente verrà comunicata allo sperimentatore. La procedura deve essere trascritta in un documento contenuto nella busta, firmando e datando tale registro il responsabile presso il centro centrale di randomizzazione.

Saranno preventivamente preparate capsule di identico aspetto esterno contenenti acido oleico (placebo) e acido docosaesaenoico alla dose di 500 mg per capsula. Le capsule sono rivestite con un involucro protettivo che ne rende il gusto impercettibile per il paziente. Il dosaggio di DHA sarà di 4 g al giorno. Con gli stessi intervalli, i pazienti del gruppo placebo assumeranno 4 g al giorno di acido oleico.

Raccolta dati: i dati dei pazienti saranno raccolti da un medico dedicato interamente a guidare i pazienti, coordinare i test da eseguire e registrare le informazioni in un database. I dati saranno raccolti in uno specifico taccuino di dati di raccolta precedentemente progettato.

o Valutazione della dimensione del campione per specificare il numero di partecipanti o gli anni dei partecipanti necessari per dimostrare un effetto.

Stima della dimensione del campione e analisi dei dati:

Si prevede di poter mostrare una differenza a favore del trattamento attivo nella variabile principale, vale a dire, riduzione dei valori dei trigliceridi alla fine del periodo di follow-up (48 settimane) di almeno il 20% in grandezza, nel confronto delle medie rettificate da un'analisi di covarianza. Secondo la deviazione standard stimata di 86 dai nostri dati, coerente con i dati della letteratura (AIDS 1999, 13:1424-1425), e l'entità dell'effetto minimo predefinito come rilevante (riduzione del 20%), sarebbe sufficiente a circa 29 pazienti valutabili per gruppo. Si intende reclutare più pazienti come previsione di possibili perdite attese di circa il 10%, ovvero 33 soggetti per gruppo.

Nuova stima della dimensione del campione:

Poiché la variabilità è stimata dai dati di altre situazioni (dati di riferimento pre-trattamento) e non ci sono dati concreti sulla situazione sperimentale (variabilità dopo il trattamento con DHA), è predefinito in questo protocollo eseguire una nuova stima della dimensione del campione quando si otterrà un follow up del 50% dopo 4 settimane di trattamento dei valori dei trigliceridi. A questo scopo i dati oggettivi della variabile principale, i livelli di trigliceridi al basale e dopo 4 settimane post-trattamento, insieme all'assegnazione casuale ma mascherando i codici, saranno forniti a un secondo gruppo statistico indipendente (Istituto catalano di oncologia, Dipartimento di epidemiologia e cancro Registrazione. Statistico: Dr. Victor Moreno) rispetto all'analisi statistica centrale di questo studio (Laboratorio di Biostatistica ed Epidemiologia (LBE), Sezione Sperimentazioni Cliniche, Università Autonoma di Barcellona. Statistico: Dott. Ferran Torres). Questo nuovo gruppo eseguirà l'analisi e rivelerà solo i dati di variabilità per ricalcolare la dimensione del campione. Se la dimensione del campione fosse inferiore al previsto, verrà mantenuta in base al progetto iniziale. In nessun caso verranno eseguiti test di significatività o lo studio verrà interrotto prematuramente in secondo luogo per stimare nuovamente la variabilità. Secondo questo metodo, non è necessario alcun aggiustamento della molteplicità.

o Pianificare i dati mancanti per affrontare le situazioni in cui le variabili sono segnalate come mancanti, non disponibili, "non riportate", non interpretabili o considerate mancanti a causa di incoerenza dei dati o risultati fuori intervallo Trattamento dei valori mancanti

L'analisi principale per intenzione al trattamento richiederà l'utilizzo di tutti i soggetti senza deviazioni rilevanti dai criteri di selezione, che hanno assunto almeno una dose del farmaco studiato e che hanno una valutazione prospettica della variabile principale, almeno a tre mesi dal follow su. In base a questa ipotesi, si prevede che in uno studio di 1 anno di follow-up si trovino soggetti con misurazioni non effettuate. Pertanto si dispone l'imputazione dei valori mancanti della variabile principale come segue:

• Se la mancanza di dati è dovuta a problemi di efficienza, o la causa è sconosciuta, sarà attribuito il valore percentile del 95% per il gruppo di studio.
• In caso di dati mancanti per altri motivi, verrà implementato il metodo LOCF (Last Observation Carried Forward) a condizione che sia disponibile un valore di almeno tre mesi dopo la sua misurazione di base.

La procedura dettagliata sarà inclusa nel rapporto statistico e si prevede di valutare la coerenza del metodo prima di chiudere il database in una riunione in cui saranno facilitati elenchi anonimi per la sua valutazione 'Blind Review' dove la procedura può essere rivalutata ( CPMP/EWP/1776/99: Punti da considerare sui dati mancanti).

Difficoltà e limiti dello studio:

Il numero di pazienti e la gestione peculiare che avranno, a causa degli ulteriori esami eseguiti, rendono lo studio inevitabilmente complesso. Tuttavia, ci sarà un medico che coordinerà in modo permanente tutti i pazienti e tutti i test eseguiti. Inoltre, il gruppo di ricerca è ampio con funzioni concrete e sinergiche per ogni ricercatore. Infine, i ricercatori costituiscono un gruppo consolidato e hanno esperienza in studi precedenti con requisiti simili.

o Piano di analisi statistica che descriva i principi analitici e le tecniche statistiche da impiegare per affrontare gli obiettivi primari e secondari, come specificato nel protocollo o nel piano dello studio.

Analisi statistica Analisi descrittiva

I seguenti indici descrittivi saranno dettagliati nel rapporto statistico in base alla natura delle variabili:

• In variabili continue: Media, CI 95%, SD, minimo, P25, mediana, P75, massimo, N e mancante. Per gruppo e globalmente.
• Nelle variabili categoriali: % totale rispetto alla colonna, N in ogni categoria. Per gruppo e globalmente.
• Nelle variabili ordinali: Saranno descritte con due tabelle: una con i parametri descrittivi delle variabili continue e l'altra con le variabili categoriali.

Nei campi aperti o quando si è interessati ad elencare tutti i casi per una o più variabili, saranno descritti da liste.

Analisi inferenziale Il trattamento statistico delle variabili di efficacia primarie e secondarie sarà specificamente descritto in una sezione successiva. Per tutte le altre variabili verrà applicato il test di ipotesi appropriato in base alla loro natura: test esatto di Fisher per variabili categoriali, test t di Student per variabili continue, test U di Mann-Whitney per variabili ordinali.

Omogeneità basale tra i gruppi Verrà stabilita un'analisi della comparabilità di base dei gruppi di trattamento per quanto riguarda le variabili demografiche, i fattori di rischio e le caratteristiche cliniche al momento dell'inclusione.

Analisi dell'efficacia principale La variabile principale dell'efficacia sarà valutata confrontando la differenza tra i valori basali e finali dei diversi trattamenti utilizzando il modello ANCOVA con il valore basale del test come covariata. Le medie aggiustate sono state calcolate e gli intervalli di confidenza al 95% (95%) dal modello ANCOVA. Come criterio decisionale principale di efficacia verrà eseguito il contrasto tra le medie aggiustate all'endpoint dello studio tra i due gruppi di trattamento. Inoltre e come intento esplorativo, sarà valutato l'effetto comparato ai diversi momenti di osservazione. Non saranno apportati aggiustamenti per la molteplicità a causa della natura esplorativa di questa seconda analisi.

In caso di scostamenti rilevanti nei casi oggetto dei test parametrici, verrà applicato un approccio non parametrico mediante trasformazioni in range delle corrispondenti variabili. L'analisi principale dell'efficacia sarà effettuata con la popolazione che si intende trattare. Tuttavia, come prova della sensibilità e robustezza dei risultati, verrà fornita l'analisi nell'ambito dell'approccio del protocollo.

Test di tollerabilità e accettabilità Tutti i pazienti che sono stati randomizzati e trattati saranno inclusi nell'analisi di sicurezza. La frequenza di comparsa di eventi avversi nei due gruppi sarà confrontata utilizzando il test esatto di Fisher.

Livello di significatività In tutti i test statistici proposti il ​​livello di significatività richiesto sarà quello convenzionale (p < 0,05 bilaterale). Non sono state prese disposizioni per eseguire aggiustamenti di molteplicità tranne che nell'analisi intermedia.