Vliv DHA na změny metabolismu lipidů a sacharidů a distribuci tělesného tuku u pacientů s HIV v rámci HAART.

Hypotéza: Léčba DHA by mohla alespoň částečně zvrátit poruchy lipidů spojené s HAART a zlepšit nebo alespoň nezhoršit redistribuci tuku spojenou s HAART, aniž by vyvolala další poruchy dendritických buněk a funkční schopnosti monocytů.

Proměnné: účinky léčby DHA na celkový cholesterol a jeho frakce, triglyceridy, inzulín, markery fibrinolýzy, tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α) a distribuci tuku hodnocené antropometrickými měřeními, bioimpedancí, sonografií, DEXA a CT břicha. Účinky podávání DHA na fenotyp a funkční schopnosti dendritických a mononukleárních buněk. Cíl: Zjistit, zda léčba vysokými dávkami vysoce purifikované kyseliny dokosahexanové (DHA) je schopna zcela nebo částečně zvrátit poruchy lipidů a redistribuci tuku spojené s vysoce aktivní antiretrovirovou terapií (HAART) a účinky na fenotyp a funkci dendritických buněk a monocytů Analýza dat: Základní data budou analyzována pro dobrou rovnováhu. Fisherův exaktní test bude použit k posouzení rozdílů mezi kategorickými proměnnými, Studentův t test pro spojité proměnné a Mann-Whitney test pro ordinální proměnné. Hlavní proměnnou účinnosti budou rozdíly mezi výchozími a konečnými hodnotami za použití modelu MANCOVA, který bere výchozí hodnotu jako kovariát. Účinnost bude hodnocena kontrastními upravenými průměry na konci studie mezi oběma skupinami léčby. Bude použita analýza záměru léčit.

Metodologie, která se má provádět v centrech, kde bude klinická stezka vedena, je následující: Po získání informovaného souhlasu bude pacientova základní linie vyšetřena sběrem demografických dat, stavu infekce HIV, farmakologických dat, antropometrických parametrů a bude pokračovat provést doplňkové vyšetření určené k identifikaci a definování složení tělesného tuku, distribuce tělesného tuku a provedení bazální analýzy včetně výše uvedených parametrů. Dále budou zhodnoceny hygienicko-dietetické návyky pacienta se zvláštním zřetelem na příjem alkoholu, fyzickou aktivitu a souběžnou medikaci. Tento postup bude proveden vytvořením retrospektivních deníků za posledních 7 dní. Denní kalorický příjem pacienta bude kvantifikován softwarem Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​España). Fyzická aktivita bude kvantifikována minnesotskou škálou (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Validace dotazníku o pohybové aktivitě ve volném čase v Minnesotě u španělských mužů. Am J Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Složení tělesného tuku a rozložení tělesného tuku: bude provedeno pomocí následujících dodatečných testů:

Denzitometrie nebo DEXA: Bude stanovena u pacienta v poloze na zádech s rovnými nohami a chodidly u sebe na standardizovaném vyšetřovacím stole z denzitometrického zařízení (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA). V úvodní studii enerarán více tváří různých oblastí, které budou zkopírovány a přeneseny do snímků následných studií, aby se snížila variabilita po sobě jdoucích stanovení. Bude provedeno měření tělesného tuku, tělesného složení a stanovení minerální hustoty kostí technikou duální absorpciometrie. Bude proveden celotělový "scan" (složení těla) nebo zaměřený na bederní páteř (trabekulární kost) a proximální třetinu femuru (kortikální kost) pro hodnocení v posledních dvou případech kostní denzity a případné osteopenie resp. osteoporóza.

CT břicha: Získá se provedením digitální radiografie páteře, laterolaterálním zobrazením, lokalizací L4 a získáním tomografického řezu procházejícího středem obratlového těla. Následně dojde k digitálnímu výpočtu nitrobřišního tuku a podkožního tuku s manuálním výběrem zájmové oblasti. Měřené plochy budou provedeny v cm2.

Laboratorní analýza: vzorky krve pro biochemická stanovení budou odebrány ve zkumavkách Vacutainer o objemu 10 ml bez přísad. Krev bude srážena při pokojové teplotě po dobu 30 minut a centrifugována při 2500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut. Po oddělení séra od sraženiny (asi 4-5 ml) se rozdělí na 1 alikvot 1,5 ml (pro studium lipidů) a 5-7 alikvotů po 0,5 ml alikvotech, které se zmrazí na -20 °C, dokud se provádí biochemická analýza.

Plazmatické lipidy, glukóza, glykosylovaný hemoglobin, inzulín a C-peptid: měření celkového cholesterolu a triglyceridů bude prováděno pomocí automatizovaných obchodních metod (enzymová kolorimetrie, Roche Diagnostics) přizpůsobených automatickému autoanalyzátoru Hitachi 911. Stanovení apolipoproteinů AI, B a C-III, lipoproteinu (a) bude probíhat zprostředkovaně komerčními metodami (imunoturbidimetrický test, Roche Diagnostics a Wako Chemicals) přizpůsobenými automatickému autoanalyzátoru Hitachi 911. Stanovení cholesterolových lipoproteinových frakcí (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) bude provedeno těmito metodami: VLDL separovaný ultracentrifugací flotace, cholesterol HDL stanovený přímou metodou (Roche Diagnostics) a cholesterol LDL stanovený rozdílem. v celkovém cholesterolu a frakcích VLDL a HDL cholesterolu. Glukóza: komerční metodou (enzymová kolorimetrie, Roche Diagnostics) upravenou pro automatický autoanalyzátor Hitachi 747. Koncentrace inzulínu v séru bude stanovena nekompetitivní chemiluminiscenční enzymovou imunoanalýzou (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) . Koncentrace C-peptidu v séru se stanoví nekompetitivním chemiluminiscenčním enzymovým imunotestem (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Stanovení velikosti LDL částic: Velikost LDL částic bude stanovena z celkové plazmy pomocí akrylamidové gradientové gelové elektroforézy za nedenaturačních podmínek. Bude použit standard čtyř známých pásem průměru LDL, dříve určených elektronovou mikroskopií.

Stanovení mastných kyselin v plazmě: Compliance léčby bude potvrzena stanovením složení mastných kyselin v plazmatických lipidech pomocí plynové chromatografie. Celkové lipidy v plazmě budou extrahovány metodou Bligha a Dyera s chloroformem:methanolem (2:1, V:V). Methylestery mastných kyselin budou získány transesterifikací fluoridem boritým v methanolu při 80 °C po dobu 60 min. což umožňuje vysokou výtěžnost všech lipidických sloučenin včetně PUFA. Alikvotní podíl obsahující methylestery mastných kyselin bude analyzován pomocí zařízení pro plynovou chromatografii (Hewlett-Packard model 5890) na 30m. Kolona RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) o vnitřním průměru 0,25 mm vybavená plamenoionizačním detektorem. Nosným plynem bude helium o tlaku 105 kPa. Pro úplnou separaci různých sloučenin má dvě nastavení teploty: 140 °C-200 °C až 3 °C/min nebo ve dvou stupních 140 °C-180 °C až 4 °C/min a 180 ° C-210 °C při 2 °C/min. Teplota injektoru a detektoru je 260 °C. Lineární odezva detektoru bude pravidelně testována se standardními směsmi. Typicky se použijí dva vnitřní standardy s různou molekulovou hmotností (13:0 a 23:0 nebo 27:0). Špičky budou integrovány s integrátorem D-2500 (Hitachi Ltd., Tokio) a identifikovány porovnáním retenčních časů se standardy. V případě potřeby může být identifikace potvrzena hmotnostní spektrometrií (detektor Hewlett-Packard model 5970B) při ionizačním potenciálu 70 eV.

Studie markerů zánětu: krev bude odebrána do zkumavky s 5 ml EDTA. Po extrakci se zkumavka odstředí a plazma se shromáždí v Eppendorfových zkumavkách a zmrazí při -70 °C až do stanovení cytokinů. Obsah TNF-alfa, IL-1 beta a IL-6 ve vzorcích plazmy bude měřen pomocí ELISA. Každý vzorek bude analyzován v duplikátech pomocí souprav ELISA "R ​​& D Systems" podle specifikací komerčního dodavatele.

Intervence: Pacienti budou randomizováni do jedné ze dvou léčebných skupin (placebo a DHA) pomocí centralizovaného randomizačního seznamu. Studie bude provedena podle metodiky dvojitě zaslepené studie, ve které ani pacient, ani lékař neznají účinnou látku podávanou pacientům. Randomizační procedura bude provedena přiřazením jedné ze strategií podle randomizačního schématu generovaného modulem PROC PLAN SAS (verze 8.2) v násobcích 2 bloků a podle vzoru 1:1 stratifikovaného podle středu. Podle výše uvedeného bude vygenerován seznam náhodných přidělení, z něhož bude vydána zapečetěná neprůhledná obálka označená pořadovým číslem a názvem střediska. Obálky budou uloženy v centru centrální správy a analýzy dat, které bude působit jako koordinátor centralizovaného randomizačního přidělování prostřednictvím telefonického kontaktu.

Pacienti budou hodnoceni pro zařazení do studie a jejich osobní údaje budou shromážděny v konkrétním sběrném datovém zápisníku. Po proceduře informovaného souhlasu a pokud pacient souhlasí se zařazením do studie, bude kontaktováno centralizované centrum randomizace. Když jsou data pacienta zaregistrována, obálka se otevře a strategie přiřazená pacientovi bude oznámena zkoušejícímu. Postup musí být přepsán do dokumentu obsaženého v obálce, přičemž tento registr podepíše a datuje odpovědná osoba v centrálním randomizačním centru.

Předem budou připraveny kapsle s identickým vnějším vzhledem obsahující kyselinu olejovou (placebo) a kyselinu dokosahexaenovou v dávkách 500 mg na kapsli. Tobolky jsou potaženy ochranným obalem, díky kterému je chuť pro pacienta nepostřehnutelná. Dávkování DHA bude 4 g denně. Ve stejných intervalech budou pacienti ve skupině s placebem užívat 4 g kyseliny olejové denně.

Sběr dat: Údaje o pacientech bude shromažďovat lékař, který se věnuje výhradně vedení pacientů, koordinaci provádění testů a zaznamenávání informací do databáze. Data budou shromažďována v dříve navrženém specifickém sběrném datovém zápisníku.

o Posouzení velikosti vzorku ke specifikaci počtu účastníků nebo účastnických let nezbytných k prokázání účinku.

Odhad velikosti vzorku a analýza dat:

Očekává se, že bude schopen vykázat rozdíl ve prospěch aktivní léčby v hlavní proměnné, konkrétně snížení hodnot triglyceridů na konci období sledování (48 týdnů) o minimálně 20 % v rozsahu srovnání průměrů upravených kovarianční analýzou. Podle odhadované směrodatné odchylky 86 od našich vlastních dat v souladu s literárními údaji (AIDS 1999, 13:1424-1425) a velikosti minimálního účinku předem definovaného jako relevantního (snížení o 20 %) by stačilo přibližně 29 hodnotitelných pacientů na skupinu. Je zamýšleno získat více pacientů podle prognózy možných očekávaných ztrát asi 10 %, jinými slovy 33 subjektů na skupinu.

Přehodnocení velikosti vzorku:

Vzhledem k tomu, že variabilita se odhaduje z údajů z jiných situací (základní data před léčbou) a neexistují žádné konkrétní údaje o experimentální situaci (variabilita po léčbě DHA), je v tomto protokolu předem definováno provést přehodnocení velikosti vzorku kdy bude dosaženo sledování 50 % hodnot triglyceridů po 4 týdnech léčby. K tomuto objektivnímu datu z hlavní proměnné, hladiny triglyceridů na začátku a po 4 týdnech po léčbě, spolu s náhodným přiřazením, ale maskováním kódů, budou poskytnuta druhé nezávislé statistické skupině (Katalánský onkologický ústav, Oddělení epidemiologie a rakoviny Registrace. Statistik: Dr. Victor Moreno) s ohledem na centrální statistickou analýzu této studie (Laboratoř biostatistiky a epidemiologie (LBE), Sekce klinických zkoušek, Autonomní univerzita v Barceloně). Statistik: Dr. Ferran Torres). Tato nová skupina provede analýzu a odhalí pouze údaje o variabilitě pro přepočet velikosti vzorku. Pokud byla velikost vzorku menší, než se očekávalo, bude zachována podle původního návrhu. Za žádných okolností nebudou prováděny testy významnosti nebo bude studie sekundárně předčasně zastavena, aby se znovu odhadla variabilita. Podle této metody nepotřebujete žádnou úpravu násobnosti.

o Plánujte chybějící data pro řešení situací, kdy jsou proměnné hlášeny jako chybějící, nedostupné, „nevykazované“, neinterpretovatelné nebo považovány za chybějící z důvodu nekonzistence dat nebo výsledků mimo rozsah Zpracování chybějících hodnot

Hlavní analýza záměru léčit bude vyžadovat použití všech subjektů bez relevantních odchylek od výběrových kritérií, kterým užili alespoň jednu dávku studované medikace a kteří mají vyhodnocenou hlavní proměnnou prospektivně, alespoň po třech měsících sledování. nahoru. Za tohoto předpokladu se očekává, že v jednoletém sledování najdou subjekty s neprovedenými měřeními. Proto je imputace chybějících hodnot hlavní proměnné stanovena takto:

• Pokud je nedostatek údajů způsoben problémy s účinností nebo je příčina neznámá, přiřadí se 95% percentilová hodnota pro studijní skupinu.
• V případě chybějících dat z jiných důvodů bude implementována metoda LOCF (Last Observation Carried Forward) za předpokladu dostupnosti hodnoty alespoň tři měsíce po jejím základním měření.

Podrobný postup bude zahrnut do statistické zprávy a plánuje se vyhodnocení konzistence metody před uzavřením databáze na schůzce, na které bude umožněno anonymní výpisy pro její vyhodnocení „Blind Review“, kde může být postup přehodnocen ( CPMP/EWP/1776/99: Body ke zvážení u chybějících dat).

Obtíže a omezení studia:

Počet pacientů a zvláštní management, který budou mít, kvůli dodatečným provedeným testům, činí studii nevyhnutelně složitou. Bude zde však lékař, který trvale koordinuje všechny pacienty a všechna prováděná vyšetření. Výzkumný tým je navíc široký s konkrétními a synergickými funkcemi pro každého výzkumníka. Konečně, výzkumní pracovníci tvoří konsolidovanou skupinu a mají zkušenosti z předchozích studií s podobnými požadavky.

o Plán statistické analýzy popisující analytické principy a statistické techniky, které mají být použity k řešení primárních a sekundárních cílů, jak je specifikováno v protokolu nebo plánu studie.

Statistická analýza Popisná analýza

Následující popisné indexy budou ve statistické zprávě podrobně popsány podle povahy proměnných:

• V spojitých proměnných: Průměr, CI 95 %, SD, minimum, P25, medián, P75, max, N a chybí. Na skupinu a globálně.
• V kategoriálních proměnných: % celkem vzhledem ke sloupci, N v každé kategorii. Na skupinu a globálně.
• V ordinálních proměnných: Budou popsány dvěma tabulkami: jedna s popisnými parametry spojitých proměnných a druhá s kategorickými proměnnými.

V otevřených polích nebo v případě zájmu vypsat všechny případy pro jednu nebo více proměnných budou popsány seznamy.

Inferenční analýza Statistické zpracování primárních a sekundárních proměnných účinnosti bude konkrétně popsáno v části níže. Pro všechny ostatní proměnné bude aplikován vhodný test hypotézy podle jejich povahy: Fisherův exaktní test pro kategorické proměnné, Studentův t test pro spojité proměnné, Mann-Whitney U test pro ordinální proměnné.

Bazální homogenita mezi skupinami Bude provedena analýza výchozí srovnatelnosti léčebných skupin s ohledem na demografické proměnné, rizikové faktory a klinické charakteristiky v době zařazení.

Analýza hlavní účinnosti Hlavní proměnná účinnosti bude vyhodnocena porovnáním rozdílu mezi výchozími a konečnými hodnotami různých léčeb pomocí modelu ANCOVA se základní hodnotou testu jako kovariát. Byly vypočteny upravené průměry a intervaly spolehlivosti 95 % (95 %) pomocí modelu ANCOVA. Jako hlavní rozhodovací kritérium účinnosti bude proveden kontrast mezi upravenými průměry na konci studie mezi dvěma léčebnými skupinami. Kromě toho a jako průzkumný záměr se vyhodnotí porovnávaný účinek v různých časech pozorování. Vzhledem k průzkumné povaze této druhé analýzy nebudou provedeny žádné úpravy násobnosti.

V případě relevantních odchylek v případech dle parametrických testů bude aplikován neparametrický přístup s využitím transformací na rozsahy odpovídajících proměnných. Hlavní analýza účinnosti bude provedena u populace určené k léčbě. Jako důkaz citlivosti a robustnosti výsledků však bude poskytnuta analýza podle protokolu.

Testy snášenlivosti a přijatelnosti Všichni pacienti, kteří byli randomizováni a léčeni, budou zahrnuti do analýzy bezpečnosti. Frekvence výskytu nežádoucích účinků v obou skupinách bude porovnána pomocí Fisherova exaktního testu.

Hladina významnosti Ve všech navrhovaných statistických testech musí být požadovaná hladina významnosti konvenční (p < 0,05 bilaterální). Nebyla přijata žádná opatření k provedení jakékoli úpravy násobnosti s výjimkou průběžné analýzy.