Wpływ DHA na zmiany metabolizmu lipidów i węglowodanów oraz dystrybucję tkanki tłuszczowej u pacjentów z HIV w ramach HAART.

Hipoteza: Leczenie DHA mogłoby przynajmniej częściowo cofnąć zaburzenia lipidowe związane z HAART i poprawić lub przynajmniej nie pogorszyć redystrybucji tłuszczu związanej z HAART, bez wywoływania dalszych zaburzeń w funkcjonowaniu komórek dendrytycznych i monocytów.

Zmienne: wpływ leczenia DHA na cholesterol całkowity i jego frakcje, trójglicerydy, insulinę, markery fibrynolizy, czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) oraz dystrybucję tkanki tłuszczowej oceniane za pomocą pomiarów antropometrycznych, bioimpedancji, ultrasonografii, DEXA i TK jamy brzusznej. Wpływ podawania DHA na fenotyp i możliwości funkcjonalne komórek dendrytycznych i jednojądrzastych. Cel: ustalenie, czy leczenie dużymi dawkami wysoko oczyszczonego kwasu dokozaheksaenowego (DHA) jest w stanie całkowicie lub częściowo cofnąć zaburzenia lipidowe i redystrybucję tłuszczu związane z wysoce aktywną terapią przeciwretrowirusową (HAART) oraz wpływ na fenotyp i funkcję komórek dendrytycznych i monocytów Analiza danych: Dane wyjściowe zostaną przeanalizowane w celu uzyskania właściwej równowagi. Do oceny różnic między zmiennymi kategorialnymi zostanie wykorzystany test dokładny Fishera, test t-Studenta dla zmiennych ciągłych oraz test Manna-Whitneya dla zmiennych porządkowych. Główną zmienną skuteczności będą różnice między wartościami początkowymi i końcowymi przy użyciu modelu MANCOVA przyjmującego wartość wyjściową jako zmienną towarzyszącą. Skuteczność zostanie oceniona przez porównanie skorygowanych średnich na koniec badania między obiema grupami leczenia. Wykorzystana zostanie analiza zamiaru leczenia.

Metodyka postępowania w ośrodkach, w których będzie prowadzona ścieżka kliniczna jest następująca: Po uzyskaniu świadomej zgody, zostanie przebadany stan wyjściowy pacjenta z zebraniem danych demograficznych, statusu zakażenia wirusem HIV, danych farmakologicznych, parametrów antropometrycznych i będzie kontynuowany przeprowadzenie badania uzupełniającego mającego na celu rozpoznanie i określenie składu tkanki tłuszczowej, rozkładu tkanki tłuszczowej oraz wykonanie analizy podstawowej uwzględniającej wymienione wcześniej parametry. Ocenione zostaną również nawyki higieniczno-dietetyczne chorego ze szczególnym uwzględnieniem spożywania alkoholu, aktywności fizycznej oraz przyjmowanych jednocześnie leków. Procedura ta zostanie przeprowadzona poprzez sporządzenie retrospektywnych dzienników z ostatnich 7 dni. Dzienne spożycie kalorii przez pacjenta zostanie określone ilościowo przez oprogramowanie Nutrilogic ® (Bio Logic, Barcelona, ​​Hiszpania). Aktywność fizyczna będzie oceniana ilościowo za pomocą skali Minnesoty (Elosua R, Marrugat J, Molina L, Pons S, The MARATHOM Investigators. Walidacja kwestionariusza aktywności fizycznej w czasie wolnym od Minnesoty u hiszpańskich mężczyzn. Am J. Epidemiol 1994, 139: 1197-1209).

Skład tkanki tłuszczowej i dystrybucja tkanki tłuszczowej: zostaną wykonane za pomocą następujących dodatkowych testów:

Densytometria lub DEXA: Zostanie określona u pacjenta w pozycji leżącej z wyprostowanymi nogami i stopami razem, na standardowym stole do badań z urządzenia densytometrycznego (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA). W początkowym badaniu enerarán więcej twarzy różnych regionów, które zostaną skopiowane i przeniesione do obrazów z kolejnych badań, aby zmniejszyć zmienność kolejnych oznaczeń. Przeprowadzony zostanie pomiar tkanki tłuszczowej, składu ciała oraz ocena gęstości mineralnej kości metodą absorpcjometrii podwójnej. Wykonany zostanie „skan” całego ciała (skład ciała) lub skupiony na odcinku lędźwiowym kręgosłupa (kość beleczkowata) i bliższej jednej trzeciej kości udowej (kość korowa) w celu oceny w dwóch ostatnich przypadkach gęstości mineralnej kości i ewentualnej osteopenii lub osteoporoza.

Tomografia komputerowa jamy brzusznej: zostanie uzyskana poprzez wykonanie cyfrowej radiografii kręgosłupa, projekcji boczno-bocznej, zlokalizowaniu L4 i uzyskaniu przekroju tomograficznego przechodzącego przez środek trzonu kręgu. Następnie nastąpi cyfrowe obliczenie tłuszczu w jamie brzusznej i tłuszczu podskórnego, ręcznie wybierając obszar zainteresowania. Zmierzone powierzchnie zostaną podane w cm2.

Analiza laboratoryjna: próbki krwi do oznaczeń biochemicznych będą pobierane w probówkach Vacutainer o pojemności 10 ml bez dodatków. Krew będzie krzepnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut i odwirowywana przy 2500 obr./min przez 15 minut. Po oddzieleniu surowicy od skrzepu (około 4-5 ml), zostanie ona podzielona na 1 porcję po 1,5 ml (do badania lipidów) i 5-7 porcji po 0,5 ml, które zostaną zamrożone w temperaturze -20 °C do przeprowadza się analizę biochemiczną.

Lipidy osocza, glukoza, glikozylowana hemoglobina, insulina i C-peptyd: pomiary cholesterolu całkowitego i triglicerydów będą wykonywane przy użyciu automatycznych metod handlowych (kolorymetria enzymatyczna, Roche Diagnostics) dostosowanych do automatycznego analizatora Hitachi 911. Oznaczanie apolipoprotein AI, B i C-III, lipoproteiny (a) odbywać się będzie pośrednimi metodami komercyjnymi (test immunoturbidymetryczny, Roche Diagnostics i Wako Chemicals) przystosowanymi do automatycznego analizatora Hitachi 911. Oznaczanie frakcji cholesterolowych lipoprotein (Lipid, ELIP) (VLDL, LDL, HDL) zostanie wykonane następującymi metodami: VLDL oddzielone metodą ultrawirowania flotacyjnego, cholesterol HDL oznaczany metodą bezpośrednią (Roche Diagnostics) oraz cholesterol LDL oznaczany metodą różnicową cholesterolu całkowitego oraz frakcji VLDL i HDL cholesterolu. Glukoza: metodą komercyjną (kolorymetria enzymatyczna, Roche Diagnostics) przystosowaną do automatycznego analizatora Hitachi 747. Stężenie insuliny w surowicy zostanie określone za pomocą niekompetycyjnego testu immunoenzymatycznego chemiluminescencyjnego (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) . Stężenie peptydu C w surowicy określa się za pomocą niekompetycyjnego testu immunoenzymatycznego chemiluminescencyjnego (Immulite 2000TM, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA).

Określenie wielkości cząstek LDL: Wielkość cząstek LDL zostanie określona z całkowitego osocza przy użyciu elektroforezy w żelu z gradientem akryloamidu w warunkach niedenaturujących. Zastosowany zostanie wzorzec czterech znanych prążków średnicy LDL, określonych uprzednio za pomocą mikroskopii elektronowej.

Oznaczanie kwasów tłuszczowych w osoczu: Przestrzeganie zaleceń dotyczących leczenia zostanie potwierdzone przez określenie składu kwasów tłuszczowych lipidów osocza za pomocą chromatografii gazowej. Całkowite lipidy osocza będą ekstrahowane metodą Bligha i Dyera za pomocą chloroformu:metanolu (2:1, V:V). Estry metylowe kwasów tłuszczowych będą otrzymywane poprzez transestryfikację trifluorkiem boru w metanolu w temperaturze 80°C przez 60 min. co pozwala na wysoki odzysk wszystkich związków lipidowych, w tym PUFA. Próbki zawierające estry metylowe kwasów tłuszczowych będą analizowane za pomocą urządzenia do chromatografii gazowej (Hewlett-Packard model 5890) na 30 urn. Kolumna RTX-2330 (Restek, Bellefonte, PA) o średnicy wewnętrznej 0,25 mm wyposażona w detektor płomieniowo-jonizacyjny. Gazem nośnym będzie hel pod ciśnieniem 105 kPa. Do całkowitego oddzielenia różnych związków zapewnia dwa ustawienia temperatury: 140°C-200°C do 3°C/min lub w dwóch etapach 140°C-180°C do 4°C/min i 180°C C-210°C przy 2°C/min. Temperatura wtryskiwacza i detektora wynosi 260°C. Liniowa odpowiedź detektora będzie okresowo testowana przy użyciu mieszanin wzorcowych. Zazwyczaj stosuje się dwa wzorce wewnętrzne o różnej masie cząsteczkowej (13:0 i 23:0 lub 27:0). Piki zostaną zintegrowane z integratorem D-2500 (Hitachi Ltd., Tokio) i zidentyfikowane przez porównanie czasów retencji ze standardami. W razie potrzeby identyfikację można potwierdzić za pomocą spektrometrii mas (detektor Hewlett-Packard model 5970B) przy potencjale jonizacji 70 eV.

Badanie markerów stanu zapalnego: krew zostanie pobrana do 5 ml probówki z EDTA. Po ekstrakcji probówka zostanie odwirowana, a osocze zebrane do probówek Eppendorfa i zamrożone w temperaturze -70°C do czasu oznaczenia cytokin. Zawartość TNF-alfa, IL-1 beta i IL-6 w próbkach osocza będzie mierzona metodą ELISA. Każda próbka zostanie przeanalizowana w dwóch powtórzeniach przy użyciu zestawów ELISA „R & D Systems” zgodnie ze specyfikacjami dostawcy komercyjnego.

Interwencja: Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup terapeutycznych (placebo i DHA), przy użyciu scentralizowanej listy randomizacyjnej. Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z metodologią podwójnie ślepej próby, w której ani pacjent, ani lekarz nie są świadomi podawanej pacjentom substancji czynnej. Procedura randomizacji zostanie przeprowadzona poprzez przypisanie którejkolwiek ze strategii zgodnie ze schematem randomizacji wygenerowanym przez moduł PROC PLAN SAS (wersja 8.2) w wielokrotności 2 bloków i zgodnie ze wzorem 1:1 warstwowanym według środka. Lista losowych przydziałów zostanie wygenerowana zgodnie z powyższym iz tego samego powodu zostanie wydana zapieczętowana nieprzezroczysta koperta, identyfikowana numerem porządkowym i nazwą ośrodka. Koperty zostaną zdeponowane w centrum centralnego zarządzania i analizy danych, które będzie pełnić rolę koordynatora scentralizowanego przydziału randomizacji poprzez kontakt telefoniczny.

Pacjenci zostaną poddani ocenie pod kątem włączenia do badania, a ich dane osobowe zostaną zebrane w specjalnym zeszycie danych. Po procedurze świadomej zgody i jeśli pacjent wyrazi zgodę na włączenie do badania, skontaktuje się ze scentralizowanym ośrodkiem przydziału do randomizacji. Po zarejestrowaniu danych pacjenta koperta zostanie otwarta, a strategia przypisana pacjentowi zostanie zgłoszona badaczowi. Procedura zostanie przepisana na dokument znajdujący się w kopercie, podpisując i datując ten rejestr osobę odpowiedzialną w centralnym ośrodku randomizacji.

Kapsułki o identycznym wyglądzie zewnętrznym zawierające kwas oleinowy (placebo) i kwas dokozaheksaenowy w dawce 500 mg na kapsułkę zostaną wcześniej przygotowane. Kapsułki pokryte są ochronną otoczką, dzięki czemu smak jest niewyczuwalny dla pacjenta. Dawka DHA wyniesie 4 g dziennie. W tych samych odstępach czasu pacjenci z grupy placebo będą przyjmować codziennie 4 g kwasu oleinowego.

Gromadzenie danych: Dane pacjentów będą zbierane przez lekarza całkowicie poświęconego prowadzeniu pacjentów, koordynowaniu badań do wykonania i zapisywaniu informacji w bazie danych. Dane będą gromadzone we wcześniej zaprojektowanym notatniku do zbierania danych.

o Ocena liczebności próby w celu określenia liczby uczestników lub lat uczestnictwa niezbędnych do wykazania efektu.

Szacowanie wielkości próby i analiza danych:

Oczekuje się, że będzie w stanie wykazać różnicę na korzyść aktywnego leczenia w głównej zmiennej, a mianowicie zmniejszeniu wartości triglicerydów na koniec okresu obserwacji (48 tygodni) o co najmniej 20% wielkości, w porównanie średnich skorygowanych analizą kowariancji. Zgodnie z oszacowanym odchyleniem standardowym 86 z danych własnych, zgodnym z danymi literaturowymi (AIDS 1999, 13:1424-1425) i wielkością minimalnego efektu predefiniowanego jako istotny (redukcja o 20%), wystarczyłoby około 29 ocenianych pacjentów na grupę. Ma na celu rekrutację większej liczby pacjentów zgodnie z prognozą możliwych oczekiwanych strat około 10%, czyli innymi słowy, 33 pacjentów na grupę.

Ponowne oszacowanie wielkości próby:

Ponieważ zmienność jest szacowana na podstawie danych z innych sytuacji (dane wyjściowe przed leczeniem), a nie ma konkretnych danych dotyczących sytuacji eksperymentalnej (zmienność po leczeniu DHA), w niniejszym protokole wstępnie zdefiniowano ponowne oszacowanie wielkości próby kiedy zostanie uzyskana kontynuacja 50% po 4 tygodniach leczenia wartości triglicerydów. W tym celu dane z głównej zmiennej, poziomów triglicerydów na początku badania i po 4 tygodniach po leczeniu, wraz z losowym przydziałem, ale maskowaniem kodów, zostaną dostarczone do drugiej niezależnej grupy statystycznej (Kataloński Instytut Onkologii, Departament Epidemiologii i Raka Rejestracja. Statystyk: dr Victor Moreno) w odniesieniu do centralnej analizy statystycznej tego badania (Laboratorium Biostatystyki i Epidemiologii (LBE), Sekcja Badań Klinicznych, Uniwersytet Autonomiczny w Barcelonie. Statystyk: dr Ferran Torres). Ta nowa grupa przeprowadzi analizę i ujawni dane dotyczące zmienności tylko w celu ponownego obliczenia wielkości próby. Jeśli wielkość próbki była mniejsza niż oczekiwano, zostanie ona utrzymana zgodnie z pierwotnym projektem. W żadnym wypadku nie będą wykonywane testy istotności lub badanie zostanie przedwcześnie przerwane wtórnie w celu ponownego oszacowania zmienności. Zgodnie z tą metodą nie ma potrzeby dostosowywania krotności.

o Zaplanuj brakujące dane, aby uwzględnić sytuacje, w których zmienne są zgłaszane jako brakujące, niedostępne, „niezgłoszone”, niemożliwe do interpretacji lub uznane za brakujące z powodu niespójności danych lub wyników spoza zakresu Postępowanie z brakującymi wartościami

Główna analiza według zamiaru leczenia wymagać będzie uwzględnienia wszystkich osób bez istotnych odchyleń od kryteriów selekcji, którym przyjęto co najmniej jedną dawkę badanego leku i którzy mają prospektywną ocenę zmiennej głównej, co najmniej w ciągu trzech miesięcy obserwacji w górę. Przy takim założeniu oczekuje się, że w rocznym badaniu follow-up znajdą się osoby z niewykonanymi pomiarami. Dlatego ustala się imputację brakujących wartości zmiennej głównej w następujący sposób:

• Jeżeli brak danych wynika z problemów z wydajnością lub przyczyna jest nieznana, przypisuje się wartość percentyla 95% dla grupy badanej.
• W przypadku braku danych z innych przyczyn zostanie wdrożona metoda LOCF (Last Observation Carried Forward) pod warunkiem dostępności wartości przez co najmniej trzy miesiące po jej pomiarze bazowym.

Szczegółowa procedura zostanie zawarta w raporcie statystycznym i planowana jest ocena spójności metody przed zamknięciem bazy danych na spotkaniu, na którym umożliwione zostaną anonimowe zestawienia dla jej oceny „Blind Review”, gdzie procedura może zostać ponownie oceniona ( CPMP/EWP/1776/99: Punkty do rozważenia w sprawie brakujących danych).

Trudności i ograniczenia badania:

Liczba pacjentów i szczególne zarządzanie, jakie będą mieli, ze względu na wykonywane dodatkowe testy, sprawiają, że badanie jest nieuchronnie skomplikowane. Będzie jednak lekarz, który na stałe koordynuje wszystkich pacjentów i wszystkie wykonywane badania. Ponadto zespół badawczy jest szeroki z konkretnymi i synergicznymi funkcjami dla każdego badacza. Wreszcie badacze stanowią skonsolidowaną grupę i mają doświadczenie w poprzednich badaniach o podobnych wymaganiach.

o Plan analizy statystycznej opisujący zasady analityczne i techniki statystyczne, które mają być zastosowane w celu osiągnięcia głównych i drugorzędnych celów określonych w protokole lub planie badania.

Analiza statystyczna Analiza opisowa

Następujące wskaźniki opisowe zostaną wyszczególnione w raporcie statystycznym zgodnie z charakterem zmiennych:

• W zmiennych ciągłych: średnia, CI 95%, SD, minimum, P25, mediana, P75, max, N i brak. Na grupę i globalnie.
• W zmiennych kategorycznych: % ogółem w odniesieniu do kolumny, N w każdej kategorii. Na grupę i globalnie.
• W zmiennych porządkowych: Zostaną one opisane za pomocą dwóch tablic: jednej z parametrami opisowymi zmiennych ciągłych i drugiej ze zmiennymi kategorialnymi.

W otwartych polach lub gdy chcesz wylistować wszystkie przypadki dla jednej lub więcej zmiennych, zostaną one opisane za pomocą list.

Analiza wnioskowania Obróbka statystyczna pierwszorzędowych i drugorzędowych zmiennych dotyczących skuteczności zostanie szczegółowo opisana w poniższej sekcji. Dla wszystkich pozostałych zmiennych zostanie zastosowany odpowiedni test hipotezy zgodnie z jego charakterem: dokładny test Fishera dla zmiennych kategorialnych, test t Studenta dla zmiennych ciągłych, test U Manna-Whitneya dla zmiennych porządkowych.

Podstawowa jednorodność między grupami Analiza wyjściowej porównywalności grup terapeutycznych zostanie przeprowadzona w odniesieniu do zmiennych demograficznych, czynników ryzyka i charakterystyki klinicznej w momencie włączenia.

Główna analiza skuteczności Główna zmienna skuteczności zostanie oceniona przez porównanie różnicy między wartościami początkowymi i końcowymi różnych terapii z wykorzystaniem modelu ANCOVA z wartością wyjściową testu jako współzmienną. Obliczono skorygowane średnie i przedziały ufności na poziomie 95% (95%) za pomocą modelu ANCOVA. Jako główne kryterium decyzyjne dotyczące skuteczności zostanie przeprowadzony kontrast między skorygowanymi średnimi w punkcie końcowym badania między dwiema leczonymi grupami. Dodatkowo, jako zamiar eksploracyjny, ocenia się porównywany efekt w różnych momentach obserwacji. Ze względu na eksploracyjny charakter tej drugiej analizy nie zostaną wprowadzone żadne korekty dotyczące krotności.

W przypadku wystąpienia istotnych odchyleń w przypadkach z testów parametrycznych zastosowane zostanie podejście nieparametryczne z wykorzystaniem przekształceń na przedziały odpowiednich zmiennych. Główna analiza skuteczności zostanie przeprowadzona na populacji, która ma być leczona. Jednak jako dowód czułości i wiarygodności wyników zostanie przedstawiona analiza w ramach podejścia opartego na protokole.

Testy tolerancji i akceptowalności Wszyscy pacjenci, którzy zostali zrandomizowani i leczeni, zostaną włączeni do analizy bezpieczeństwa. Częstość występowania zdarzeń niepożądanych w obu grupach zostanie porównana za pomocą dokładnego testu Fishera.

Poziom istotności We wszystkich proponowanych testach statystycznych wymagany poziom istotności jest umowny (p < 0,05 dwustronny). Nie przewidziano żadnych przepisów w celu przeprowadzenia korekty krotności, z wyjątkiem analizy pośredniej.