Saját gyűjtött nyálminták vírusszállító közeg nélkül a COVID-19 teszteléséhez RT-PCR-rel

Ez egy leíró tanulmány, amely megkísérli validálni a SARS-CoV-2 kimutatására szolgáló eljárást az Eppendorf Thermal Cycler PCR rendszeren, saját maga által összegyűjtött nyálat használva mintaként. A kutatók kiszámítják a százalékos egyezést és a 95%-os konfidenciaintervallumot (azaz általános egyezést, százalékos pozitív egyezést és százalékos negatív egyezést) a saját maguk gyűjtött nyálminták (az Eppendorf Thermal Cycler PCR rendszerrel értékelve) és az egészségügyi dolgozók által gyűjtött orrgaratminták között. (vagy a BioFire® FilmArray® Torch® rendszeren vagy a Cepheid® GeneXpert® mint aranystandardon értékelve). Azok a résztvevők, akik nem rendelkeznek használható eredménnyel mind a nyál-, mind a nasopharyngealis módszerrel, nem kerülnek bele az elemzésekbe. Jelenleg a DGMC mindkét FDA vészhelyzeti felhasználási engedélyezési rendszert felváltva használja a SARS-CoV-2 tesztelésére.

Emberi önkéntesek felhasználásával a SARS-COV-2 pozitív és negatív nasopharyngealis és nyálmintáinak beszerzésére ez egy teszt-validációs vizsgálat. Az Eppendorf Thermal Cycler PCR rendszert használja a minta nyál és a standard orrgarat minta tesztteljesítményének összehasonlítására.

Ez a protokoll két különböző kényelmi mintát használ a DGMC betegekből. A betegek (pl. fekvőbeteg, járóbeteg) pozitív COVID-19 teszttel az elmúlt 72 órában, valamint azok, akik COVID-19 szűrésre jelentkeznek a DGMC-ben, és negatív eredménnyel rendelkeznek. Mindkét betegcsoport 72 órán belül hajlandó nyálmintát adni a COVID-19 vizsgálathoz. A populáció aktív szolgálatot teljesítő személyekből, DoD-eltartottakból és nyugdíjasokból áll majd, akik DGMC betegek. Ebben a tanulmányban legalább 60 személy vesz részt. Csak 30 negatív és 30 pozitív NP-eredményű résztvevő nyálmintáját dolgozzák fel. A vizsgálat leállítja a pozitív betegek toborzását, miután megkapták a páros nyál- és NP-eredményeket 30 résztvevőtől, akik az NP-teszt alapján COVID-19-pozitívak. A vizsgálat leállítja a negatív betegek aktív toborzását, miután megkapták a páros nyál- és NP-eredményeket 30 résztvevőtől, akik az NP-teszt alapján COVID-19-negatívak. Több mint 30 negatív beteget toborozhatnak, hogy megkíséreljenek 30 pozitív beteget.

A pozitív betegek toborzása a HIPAA-mentesség felhasználásával történik a vizsgálat potenciális résztvevőinek azonosítása érdekében, valamint a COVID-19-tesztelésre jelentkező, COVID-19-nek kitett és/vagy azzal kapcsolatos tünetekkel rendelkező betegek megcélzásával. A HIPAA Waiver segítségével azonosítják azokat a betegeket (fekvőbeteg, járóbeteg), akiknél az elmúlt 72 órában pozitív COVID-19 NP-teszt volt. Ezeket a betegeket, valamint másokat, akiknél COVID-19-tesztet végeznek a DGMC-ben, tájékoztatják a vizsgálatról.

A részvétel iránt érdeklődő betegek kapcsolatba lépnek a vizsgálati személyzettel. A részvételre jogosultak vizsgálati dokumentumokat (beleegyezés és HIPAA engedélyezési űrlap) kapnak, amelyeket a páciens és a vizsgálati személyzet később átnéz és aláír. Ezt követően további információkat (kontaktus, demográfiai adatok) és saját gyűjtött nyálmintát kapunk.

A COVID-19-pozitív vagy potenciálisan fertőzött betegekkel való érintkezés minimalizálása érdekében a dokumentumok aláírásakor és a saját maga által gyűjtött nyálminta beszerzésekor a személyzet bőrradírt (vagy laborköpenyt), kesztyűt, szemvédőt és N95 maszkot visel. Az aláírást igénylő dokumentumokat a páciens maszkot viselve írja alá, és legalább 6 láb távolságot tart a vizsgálati személyzettől vagy járművétől. A hozzájárulást és a HIPAA engedélyezési űrlapot aláírják. Az eredeti, aláírt dokumentumokat a vizsgálati személyzet megőrzi, és egy másolatot a résztvevő rendelkezésére bocsátunk. Miután mindkét dokumentumot aláírták, a vizsgálati személyzet megkapja a demográfiai (életkor, etnikai hovatartozás, faj és nem) és elérhetőségi adatokat (név, e-mail cím, ha a jövőbeni kapcsolat szükséges), a születési dátumot és a saját maga gyűjtött nyálmintát.

A nyálminta gyűjtése előtt a vizsgálati személyzet megbizonyosodik arról, hogy a résztvevő nem dohányzott, evett vagy ivott semmit az elmúlt 10 percben. A résztvevők bioveszélyes zacskót, címkét (6 számjegyű számkóddal), 25 ml-es műanyag minta csövet kapnak, benne szállítóközeg nélkül. Ezután megkérték, hogy töltsék meg körülbelül 2 ml nyállal. A csövön egy jelölés található, amely biztosítja, hogy elegendő mintát gyűjtsenek. A résztvevőt arra utasítják, hogy zárja le a fedelet, helyezze a címkét a tubus külső oldalára, majd tegye a felcímkézett csövet a biológiailag veszélyes zacskóba. A résztvevők ezután a zacskóba csomagolt mintát a DGMC vagy a vizsgálati csoport egy tagja által tartott második biológiai veszélyt jelentő zacskóba helyezik. A dupla zacskóba csomagolt, öngyűjtött nyálmintát ezután a jégcsomagot tartalmazó vizsgálati hűtőbe helyezik. A nyálmintákat ezután tételesen szállítják a CIF-be.

Miután megkaptuk a páros nyál- és NP-eredményeket 30 résztvevőtől, akik NP-teszttel COVID-19-negatívak, a nyálvizsgálatot csak az NP-pozitív résztvevőktől vett mintákon végezzük el. Az ismeretlen COVID-19 státuszú, COVID-19-pozitív beteg elfogása céljából beiratkozott betegek számára hozzáférhetővé kell tenni az egészségügyi dokumentációt az NP-eredmény lekéréséhez a nyálvizsgálat elvégzése előtt. Ha az NP eredmény pozitív, nyálvizsgálatot végeznek.

A vizsgálatot nyálmintákon végzik el reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RTPCR). Természetes és/vagy szintetikus RNS-t kell begyűjteni pozitív kontrollként való felhasználáshoz. Az RT-PCR a SARS-CoV-2 E-génjét és N-génjét célozza meg.

1. A mintavételt követő 5 percen belül a mintát hidegen kell tartani a stabilizálás érdekében. Jégcsomaggal ellátott hűtőt visznek arra a helyre, ahol a résztvevő a mintát adja. A mintát egy biológiailag veszélyes zacskóba helyezik, majd azonnal a hűtőbe helyezik, és tételesen szállítják a CIF Laboratóriumba.
2. Ribonukleinsav (RNS) extrakció – 12 órán belül az RNS-t kivonják a mintákból az Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNS Mini Kit (Life Technologies) segítségével. A minta RNS-t felhasználásig -80 oC-on tároljuk.
3. A SuperScriptTM III egylépéses RT-PCR-t PlatinumTM Taq-val (Life Technologies) használják a mintákban jelenlévő virális RNS kimutatására és amplifikálására az Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf) használatával. Legfeljebb hét, a CDC-ből és más publikációkból származó primerpárt használjuk fel.18-19 Három a burokfehérje génből és négy a nukleokapszid fehérje génből.
4. A fagyasztott mintákat teszteljük és tételesen futtatjuk.
5. A PCR-termékeket gélelektroforézissel értékeljük a Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad) használatával.
6. Szekvenálás – Minden olyan PCR-reakciót, amely elfogadható amplikonokat termel, -80 oC-on tárolunk a szekvenálás esetleges megerősítéséhez az ABI 3130 (Life Technologies) segítségével.

A vizsgálat befejezése után a mintákat aliquot részekre osztják és -80 oC-on tárolják.

A nyálminták negatívnak, pozitívnak vagy nem meggyőzőnek minősülnek. Negatív érték jelenik meg, ha egyik célpontban sem történik észlelés; nem meggyőző, ha 1 célpontot észlelnek; és pozitív, ha 2 vagy több célpontot észlel.

A vizsgálati személyzet hozzáfér minden egyes SARS-CoV-2 pozitív NP-eredményhez társított laboratóriumi hozzáférési számhoz, hogy a DGMC klinikai laboratóriumától kinyomtassák a teszteléshez használt műszerből származó nyers adatokat. Ezt az információt a két vizsgálati módszer közötti esetleges eltérések értékelésére használjuk fel.