Amostras de saliva autocoletadas sem meio de transporte viral para teste de COVID-19 via RT-PCR

Este é um estudo descritivo que tentará validar o procedimento para detectar SARS-CoV-2 no sistema Eppendorf Thermal Cycler PCR usando saliva auto-coletada como amostra. Os investigadores calcularão a concordância percentual e os intervalos de confiança de 95% (ou seja, concordância geral, concordância positiva percentual e concordância negativa percentual) entre amostras de saliva coletadas pelo próprio (avaliadas no sistema Eppendorf Thermal Cycler PCR) e amostras nasofaríngeas coletadas por profissionais de saúde (avaliado no sistema BioFire® FilmArray® Torch® ou no Cepheid® GeneXpert® como padrão-ouro). Os participantes sem resultados utilizáveis ​​para os métodos saliva e nasofaríngeo não serão incluídos nas análises. Atualmente, a DGMC usa ambos os sistemas de Autorização de Uso de Emergência da FDA de forma intercambiável para testar o SARS-CoV-2.

Usando voluntários humanos para obter amostras positivas e negativas de nasofaringe e saliva de SARS-COV-2, este é um estudo de validação de teste. Ele usa o sistema Eppendorf Thermal Cycler PCR para comparar o desempenho do teste de saliva como amostra com a amostra nasofaríngea padrão.

Este protocolo utiliza duas amostras de conveniência diferentes de pacientes DGMC. Pacientes (ou seja, pacientes internados, pacientes ambulatoriais) com teste positivo de COVID-19 nas últimas 72 horas e aqueles que se apresentam para teste de COVID-19 no DGMC e apresentam resultados negativos. Ambos os grupos de pacientes estão dispostos a fornecer uma amostra de saliva para teste de COVID-19 em 72 horas. As populações serão compostas de serviço ativo, dependentes do DoD e aposentados que são pacientes do DGMC. Este estudo envolverá pelo menos 60 indivíduos. Serão processadas apenas amostras de saliva de 30 participantes com resultados negativos de NP e 30 com resultados positivos de NP. O estudo interromperá o recrutamento de pacientes positivos após a obtenção dos resultados pareados de saliva e NP de 30 participantes positivos para COVID-19 pelo teste NP. O estudo interromperá o recrutamento ativo de pacientes negativos após a obtenção dos resultados pareados de saliva e NP de 30 participantes que são negativos para COVID-19 pelo teste NP. Mais de 30 pacientes negativos podem ser recrutados na tentativa de capturar 30 pacientes positivos.

Os esforços de recrutamento para pacientes positivos serão conduzidos utilizando uma isenção HIPAA para identificar possíveis participantes do estudo, bem como, visando pacientes expostos e/ou com sintomas relacionados ao COVID-19 que se apresentam para o teste de COVID-19. O HIPAA Waiver será usado para identificar pacientes (pacientes internados, ambulatoriais) que tiveram um teste COVID-19 NP positivo nas últimas 72 horas. Esses pacientes, assim como outros que farão o teste de COVID-19 no DGMC, serão informados sobre o estudo.

Os pacientes interessados ​​em participar entrarão em contato com a equipe do estudo. Os elegíveis para participar receberão os documentos do estudo (consentimento e Formulário de Autorização HIPAA), que posteriormente serão revisados ​​e assinados pelo paciente e pela equipe do estudo. Posteriormente, serão obtidas informações adicionais (contato, demografia) e uma amostra de saliva auto coletada.

Para minimizar o contato com pacientes positivos para COVID-19 ou potencialmente infectados ao assinar documentos e obter a amostra de saliva coletada, a equipe usará jaleco (ou jaleco), luvas, proteção para os olhos e máscara N95. Os documentos que exigem assinatura serão assinados pelo paciente enquanto estiver usando uma máscara e mantendo uma distância de pelo menos 2 metros da equipe do estudo ou de seu veículo. Os Formulários de Consentimento e Autorização HIPAA serão assinados. Os documentos originais assinados serão mantidos pela equipe do estudo e uma cópia será fornecida ao participante. Depois que ambos os documentos forem assinados, a equipe do estudo obterá informações demográficas (idade, etnia, raça e sexo) e informações de contato (nome, endereço de e-mail se contato futuro for desejado), data de nascimento e a amostra de saliva coletada.

Antes de coletar a amostra de saliva, a equipe do estudo garantirá que o participante não fumou, comeu ou bebeu nada nos 10 minutos anteriores. Os participantes receberão um saco de risco biológico, etiqueta (com um código numérico de 6 dígitos), tubo de amostra de plástico de 25 ml sem meio de transporte no interior. Em seguida, pediu para preenchê-lo com aproximadamente 2 mL de saliva. Haverá uma marcação no tubo para garantir que uma amostra suficiente seja coletada. O participante será instruído a fechar a tampa, colocar o rótulo do lado de fora do tubo e, em seguida, colocar o tubo rotulado no saco de risco biológico. Os participantes então colocarão a amostra ensacada dentro de uma segunda bolsa de risco biológico mantida pelo DGMC ou por um membro da equipe de estudo. A amostra de saliva coletada em saco duplo será então colocada no refrigerador do estudo contendo uma bolsa de gelo. As amostras de saliva serão então transportadas para o CIF em lote.

Depois de obter os resultados pareados de saliva e NP de 30 participantes que são negativos para COVID-19 pelo teste NP, o teste de saliva será realizado apenas em amostras coletadas de participantes NP positivos. Pacientes com status desconhecido de COVID-19, inscritos na tentativa de capturar um paciente positivo para COVID-19, terão o prontuário acessado para recuperar o resultado de NP antes de realizar o teste de saliva. Se o resultado de NP for positivo, o teste de saliva será realizado.

Os testes serão realizados em amostras de saliva usando a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RTPCR). O RNA natural e/ou sintético será adquirido para uso como controle positivo. O RT-PCR terá como alvo o gene E e o gene N do SARS-CoV-2.

1. Dentro de 5 minutos após a coleta da amostra, a amostra será mantida fria para estabilização. Um cooler com bolsa de gelo dentro será levado até o local onde o participante fornecer a amostra. A amostra será colocada em um saco de risco biológico e imediatamente colocada no refrigerador para transporte ao Laboratório CIF em lote.
2. Extração de ácido ribonucleico (RNA) - Dentro de 12 horas, o RNA será extraído das amostras usando Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit (Life Technologies). A amostra de RNA será armazenada a -80oC até ser usada.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR com PlatinumTM Taq (Life Technologies) será usado para detecção e amplificação de RNA viral presente em amostras usando Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Serão usados ​​até sete pares de primers baseados no CDC e em outras publicações.18-19 Três do gene da proteína do envelope e quatro do gene da proteína do nucleocapsídeo.
4. Amostras congeladas serão testadas e executadas em lotes.
5. Os produtos de PCR serão avaliados por eletroforese em gel utilizando o Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Sequenciamento - Todas as reações de PCR que produzem amplicons aceitáveis ​​serão armazenadas a -80oC para possível confirmação do sequenciamento usando o ABI 3130 (Life Technologies).

Após a conclusão do teste, as amostras serão aliquotadas e armazenadas a -80oC.

As amostras de saliva serão interpretadas como negativas, positivas ou inconclusivas. Negativo será reportado quando não houver detecção em nenhum alvo; inconclusivo quando 1 alvo é detectado; e positivo quando 2 ou mais alvos são detectados.

A equipe do estudo acessará o número de acesso do laboratório associado a cada resultado NP positivo de SARS-CoV-2 para solicitar uma impressão, do laboratório clínico da DGMC, dos dados brutos do instrumento usado para realizar o teste. Esta informação será usada para avaliar quaisquer discrepâncias entre os dois métodos de teste.